前言 肺癌是发达国家的主要肿瘤，居恶性肿瘤死亡率第一位，在国内发病亦趋首位，因而引起广大学者的重视。p16基因是1994年发现的一种与多种肿瘤发生关系密切的肿瘤抑制基因(亦称为多肿瘤抑制基因，multiple tumor suppressor)。研究表明p16是一个G1期特异性细胞周期调节基因，其功能丧失所导致的细胞生长失控在肿瘤发生和发展中起重要作用。 细胞合成细胞周期素D1(简称cyclinD1)基因被认为是一种原癌基因，其表达产物也是细胞周期的重要调节因子。如果cyclinD1过表达，则可使细胞处于持续性增殖状态，进而使细胞具有恶性表型。 近年来，大量研究表明p16和cyclinD1在多种肿瘤中的表达与肿瘤的组织学类型、病理分级、临床分期及预后等因素密切相关。本研究观察了p16、cyclinD1基因在原发性肺癌组织中的表达水平及其与肿瘤病理生物学行为等的关系，旨在探讨p16和cyclinD1基因在原发性肺癌发生发展过程中的作用和相关分子病理学机制。 资料与方法 1．临床资料 收集辽宁省肿瘤医院2001年11月至2002年3月原发性肺癌标本68例。其中，男45例，女23例；年龄范围32～74岁(平均56.8岁)；组织学类型包括鳞癌24例，腺癌28例，腺鳞癌4例，小细胞肺癌12例;68例肺癌中，36例伴淋巴结转移，32例不伴淋巴结转移。每例分别取原发肿瘤及癌旁“正常”组织。标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4林m厚连续切片。每例均由两名资深病理医师做病理学诊断。 2.免疫组化方法 本实验采用S一P免疫组化方法。兔抗人pl6多克隆抗体(即用型)、鼠抗人cyclinDI单克隆抗体(即用型)、S一P试剂盒均购自福建迈新生物技术有限公司。S一P免疫组化染色严格按照操作规范进行，以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性对照片作为阳性对照。 阳性判定标准:胞核或胞浆中见清晰棕褐色颗粒者为阳性细胞。特异性免疫反应强度分级标准:阳性细胞<5%为阴性(一);阳性细胞5一25%为弱阳性(十);阳性细胞25%一50%为中度阳性(*);阳性细胞>50%为强阳性(+升)。 3.DNA图象分析 4林m厚序列切片采用Feulgen染色，应用ICM图象分析系统进行细胞核DNA含量测定，计算出DNA指数(DI值)。同时统计、分析并显示肿瘤细胞群中处于不同时相细胞的百分比，从而计算出细胞增殖指数(PI值)。 4.统计分析 所有数据均输人SPSsl 0.0统计分析软件，采用卡方检验比较组间率的差异，方差分析区别组间均值，Spe~an分析资料的等级相关性。P<0 .05视为有显著统计学差异。结果 1.68例原发肺癌中61.8%可见pl6蛋白阳性表达，其阳性率显著低于癌旁“正常”组织(。、·7%)(p<0.05);而eyelinDI在原发肺癌中的阳性率为70.6%，显著高于癌旁“正常”组织(40%)(P<0 .05)。 2.pl6、CychnDI蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型等因素无相关性(P>0.05);而与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分级以及疾病分期密切相关(P<0 .05)。 3 .pl6蛋白表达阳性肺癌中cyclinDI蛋白表达阳性率为59.5%(25/42);p16蛋白表达阴性病例中cyclinDI蛋白阳性表达率为88 .5%(23/26)。等级相关分析表明两种蛋白表达呈显著负相关(P<0 .05)。 4.随着p16蛋白表达减少，DI值呈现上升趋势，两者呈明显负相关(p<0.05);而随着eyelinnl蛋白表达增加，Dl值亦呈现上升趋势，两者呈明显正相关(P<0.05)。随着p16蛋白表达减少，PI值呈现上升趋势，两者呈显著负相关(P<0.05);而随着cy-clinDI蛋白表达增加，PI值亦呈现上升趋势，两者呈显著正相关(P<0 .05)。讨论 p16基因是一种多肿瘤抑制基因，其编码蛋白为细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的抑制因子，在细胞周期中起负反馈调节作用。当其功能丧失时，细胞生长失控导致肿瘤形成。本研究结果显示68例原发性肺癌中61 .8%病例表达pl6基因编码产物，显著低于癌旁“正常”组织(86.7%)，与文献报道相一致。研究发现p16基因在恶性肿瘤中存在突变、缺失等遗传学改变，这些改变构成p16表达下调的分子生物学基础。pl6因发生了突变、缺失等遗传学改变而导致的表达下调参与原发性肺癌的发生过程。此外，本研究结果显示P16蛋白表达降低与肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分化程度以及临床分期密切相关。提示p16在原发性肺癌中 ~—--一-一-一-----~~的表达下调导致肿瘤细胞过度增殖，进而参与其发生和演进过程。 cydinDI是细胞周期Gl*S关键限速点的重要调节因子之一。当cydin Dl扩增时，Gl 05期缩短，则可使细胞处于持续性增殖状态，导致癌的发生。本研究结果显示cyclinDI基因编码产物在原发性肺癌组织中阳性表达率为70.6%(48/68)，显著高于癌旁“正常”组织(40%，12/30)(P<0.05)。同时我们还发现cy-clinDI蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型等因素无关;而与肿瘤大小、淋巴结转移情况、病理分级以及疾病分期均均密切相关(P<0.01)。这与国内外大量报道相一致。 值得注意的是:cyclinDI和P16在