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第一部分Sprouty2蛋白在肾细胞癌中的表达研究目的:检测肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)组织中Sprouty 2蛋白的表达,研究其水平与肿瘤临床病理特征及临床转归的相关性。方法:收集行肾根治性切除术并经病理证实为肾细胞癌的103例病例(92例为透明细胞癌,11例为乳头状细胞癌),平均随访时间为51.2月,通过免疫组化及Western Bolt检测肿瘤标本中Sprouty2蛋白的表达情况,结合相应的临床病理学资料进行统计学分析。结果:与正常肾脏组织相比,RCC组织中Sprouty2蛋白的表达量明显下降,并且与肿瘤大小(P=0.002)、转移情况(P＜0.001)、临床分期(P＜0.001)、分级(P＜0.001)及生存率(P=0.001)相关,单变量(P=0.001)及多变量(P=0.035)回归分析显示Sprouty2蛋白的表达是RCC预后的独立参数指标。结论:本研究的结果证实,Sprouty2的表达水平与肾细胞癌的进展相关,Sprouty2可作为一个独立的分子标记物在肾癌的临床诊断和治疗中发挥作用。第二部分肾癌细胞中Sprouty2蛋白功能的研究目的:研究Sprouty2蛋白对肾癌细胞增殖、侵袭等生物学功能的影响。方法:采用RNAi技术,构建3组质粒,分别转染肾癌细胞系786-O,建立Sprouty2低表达细胞株,通过MTT、Transwell等技术研究Sprouty2蛋白的表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响。结果:成功构建Sprouty2低表达肾癌细胞系,对其进一步研究发现,Sprouty2表达水平下调后,肾癌细胞的增殖、侵袭能力增强,与对照组及空质粒转染组比较差异有显著性(P＜0.05)。结论:Sprouty2的表达水平对肾癌细胞的功能有一定的影响,Sprouty2表达越低,肾癌细胞的增殖及侵袭力越强,进一步支持了第一部分研究关于其表达与预后关系的结果。第三部分肾癌细胞中调控Sprouty2蛋白的机制研究目的:探讨RCC细胞中调控Sprouty2蛋白表达水平的可能机制。方法:针对抑癌基因沉默的常见机制,分别采用DNA转甲基酶抑制剂5-aza-deoxycytidine(5-Aza-CdR)及组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin(TSA)处理细胞,MTT检测细胞增殖情况,WesternBlot检测Sprouty2蛋白的表达变化,研究DNA甲基化修饰、组蛋白去乙酰化修饰等常见失活机制在Sprouty2基因沉默中的作用。采用生物信息学分析及染色质免疫共沉淀(CHIP)技术检测核转录因子-κB(NF-κB)参与Sprouty2基因转录水平调控的可能性,分别运用TNF-α以及SN50上调及下调NF-κB的活性,Western Blot检测Sprouty2蛋白的表达变化,MTT检测细胞增殖情况。结果:通过5-Aza-CdR及TSA处理细胞,Sprouty2蛋白表达量没有明显增加。CHIP显示,NF-κB可以与Sprouty2基因启动子区特异性位点相结合,调控Sprouty2蛋白的表达。通过激活或抑制NF-κB,可以使Sprouty2的表达发生变化,进而引起肾癌细胞的生物学行为改变。结论:肾细胞癌中,NF-κB的转录水平调节可能是Sprouty2蛋白低表达的重要机制。进一步的研究应从转录水平寻找Sprouty2表达调控的机制。