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气孔是由一对保卫细胞组成的控制植物水分散失和二氧化碳进出的通道,对植物的水分代谢、光合和呼吸作用至关重要,其孔径的大小受多种内在和外界因子的共同调控,如植物激素、光、水分、二氧化碳浓度、病原菌等。黄酮醇作为植物体内重要的活性氧清除剂,有研究表明其参与了乙烯抑制脱落酸（abscisic acid,ABA）诱导的气孔关闭,但关于此过程中黄酮醇的详细作用及合成的调控机制尚不清楚,对此本论文以拟南芥莲座叶片为材料,利用药理学、遗传学和生物化学等方法进行了系统的研究,得到的主要结果如下:1、10μM ABA能够显著诱导野生型（Col-0,Ler-0）叶片气孔的关闭,外源黄酮醇槲皮素和山奈酚能显著抑制ABA诱导气孔关闭的效应。与野生型相比,ABA诱导气孔关闭的程度在黄酮醇合成缺失的突变体tt4-4中显著增强,在黄酮醇过量产生突变体tt3-1中显著减弱,表明黄酮醇能抑制ABA诱导的气孔关闭。10 μM乙烯前体 1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC）显著抑制ABA诱导的野生型气孔关闭,ABA诱导的气孔关闭在乙烯过量产生突变体eto1中也极大地减弱,表明外源和内源乙烯均具有抑制ABA诱导气孔关闭的作用。ACC抑制ABA诱导的气孔关闭作用在tt4-4突变体中变弱,而在tt3-1突变体中增强,表明乙烯抑制ABA诱导的气孔关闭作用可能与保卫细胞中黄酮醇的水平有关。内源黄酮醇检测结果表明ACC与ABA复合处理显著提高野生型和tt3-1,尤其是tt3-1保卫细胞内的黄酮醇水平,对tt4-4无明显影响。相应地,ABA处理均能显著增加野生型、tt3-1、tt4-4保卫细胞中的过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）水平,其中,tt3-1增加的程度弱于野生型,tt4-4增加的程度强于野生型。ACC与ABA复合处理则显著降低了野生型和tt3-1,尤其是tt3-1保卫细胞内的H202水平,对tt4-4的影响不明显。这些结果表明黄酮醇作为H202的清除剂,通过降低H2O2的水平正调控乙烯抑制ABA诱导的气孔关闭过程。2、为了进一步研究乙烯信号途径在黄酮醇合成过程中的作用,我们使用了乙烯受体突变体etr1-3和乙烯信号转导的重要元件EIN3突变体ein3-1。ABA能够显著诱导etr1-3的气孔关闭,但ACC不能抑制ABA诱导的etr1-3气孔关闭。与野生型相比,ACC与ABA复合处理不能诱导etr1-3保卫细胞内黄酮醇水平的增加。ACC与ABA复合处理不能抑制ABA诱导的etr1-3保卫细胞内H202增加。同时还发现,ABA也显著诱导ein3-1的气孔关闭,ACC也不能抑制其ABA诱导的关闭效应,ACC与ABA复合处理不能增加其内源黄酮醇的水平,不能抑制ABA诱导的内源H202增加。以上结果从遗传角度证明了乙烯受体ETR1和信号途径重要元件EIN3是乙烯诱导保卫细胞黄酮醇积累来降低H2O2水平从而抑制ABA诱导的气孔关闭所必需的。3、为了研究乙烯诱导保卫细胞内黄酮醇合成的机制,我们研究了调控黄酮醇合成的转录因子MYB11、MYB12和MYB111在保卫细胞黄酮醇合成中的作用。结果表明在myb12-If、myb111和myb11myb12myb111突变体中,ABA诱导的气孔关闭程度强于野生型,而ACC抑制ABA诱导的气孔关闭效应则显著弱于野生型;与野生型相比,ACC与ABA复合处理后保卫细胞内源黄酮醇的增加在myb12-If、myb111尤其是myb11myb12myb111三突中显著减弱,同时内源H2O2水平表现出相反的变化。myb11在气孔开度、保卫细胞内黄酮醇和H2O2水平上均表现出类似于野生型的反应。这些结果表明转录因子MYB12和MYB111参与了乙烯诱导保卫细胞中黄酮醇合成的调控从而抑制ABA诱导的气孔关闭过程,而MYB11在此过程中可能作用不大。4、与野生型相比,在光信号通路调控因子HY5的缺失突变体hy5中,ABA诱导的气孔关闭程度更大,ACC抑制ABA诱导的气孔关闭程度显著减小,ACC与ABA复合处理后诱导的hy5保卫细胞内源黄酮醇积累显著减少,H2O2水平显著增加。HY5同源基因HYH的突变体hyh具有类似hy5的效应,但弱于hy5,hy5hyh双突的效应最强。在HY5-OX中,ABA诱导的气孔关闭效应极小,ACC也表现不出抑制ABA的效应,其保卫细胞内源黄酮醇水平在对照及各处理下均较高,H2O2水平则较低。这些结果表明转录因子HY5、HYH正调控保卫细胞内黄酮醇的合成,从而参与乙烯抑制ABA诱导的气孔关闭过程,其中HY5起主要作用。5、为探究miR858a对黄酮醇合成的影响,我们检测了过量表达株系MIR858a-OX#2、MIR858a-OX#5和表达减弱株系STTM858#1、STTM858#2气孔开度、保卫细胞内黄酮醇和H202水平的变化。与野生型相比,STTM858#1、STTM858#2的气孔对ABA诱导的关闭效应明显增强,ACC抑制ABA的效应显著减弱,ACC与ABA复合处理诱导STTM858#1、STTM858#2保卫细胞内源黄酮醇积累减少,H2O2水平增加。与野生型相比,而MIR858a-OX#2、MIR858a-OX#5的气孔对ABA诱导的关闭效应明显减弱,ACC抑制ABA诱导的气孔关闭效应显著增强;ACC与ABA复合处理诱导MIR858a-OX#2、MIR858a-OX#5保卫细胞内源黄酮醇水平明显增高,H2O2水平则降低。这些结果表明miR858a正调控了乙烯抑制ABA诱导的气孔关闭过程中保卫细胞内黄酮醇的合成,从而降低H2O2水平来调控气孔运动。6、为了探究HY5与miR858a的上下游关系,我们获得了HY5-OXSTTM858#2,hy5 ×MIR858a-OX#2杂交株系。结果表明在气孔开度、保卫细胞黄酮醇和H2O2水平上,HY5-OX×STTM858#2在对ABA与ACC处理的反应上表现出与STTM858#2相似的现象,hy5 ×MIR858a-OX#2与MIR858a-OX#2相似,表明在乙烯通过促进黄酮醇合成抑制ABA诱导的气孔关闭过程中,miR858a在HY5的下游发挥作用。综上所述,黄酮醇通过降低H2O2的水平从而参与了乙烯抑制ABA诱导的气孔关闭过程。在此过程中,转录因子MYB12、MYB111、HY5和miR858a作为正调控因子均参与了保卫细胞中黄酮醇合成的调控,且miR858a可能在HY5的下游发挥作用。