论文部分内容阅读
肌内脂肪含量对牛肉的嫩度、多汁性、风味和香气影响很大,因此提高牛肉肌内脂肪含量可以提升牛肉的品质,提高牛肉的价值。动物转基因技术可以改造动物的基因组结构和遗传组成,快速高效培育动物新品种。动物转基因最重要的上游技术就是选择理想的目的基因,为定向基因育种奠定基础。二酯酰甘油酰基转移酶(Diacylgycerol Acyltransferase 1,DGAT1)是控制三酰甘油生物合成最终限速步骤的重要酶。脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)通过与脂肪酸结合的方式,负责脂肪酸的结合和运输。过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(Peroxisome proliferator-activated receptorγ2,PPARγ2)是脂肪形成中的关键转录因子,并且调节脂肪形成过程。本研究根据实验室承担的国家转基因优质肉牛新品种培育项目的需要,选择三个脂肪沉积的基因DGAT1、FABP4、PPARγ2,在秦川牛肌卫星细胞中进行沉积脂肪能力的比较研究,为肉牛转基因育种提供技术依据。本研究的主要结果如下:1.牛DGAT1、FABP4、PPARγ2过表达载体构建(1)以秦川牛脂肪组织c DNA为模板,克隆了秦川牛DGAT1、FABP4、PPARγ2的CDS区。(2)以pEGFP-N1为骨架载体,构建了过表达载体pEGFP-N1-DGAT1、pEGFP-N1-FABP4、pEGFP-N1-PPARγ2,经过双酶切检测和Sanger测序检测表明,证明过表达载体构建正确。2.秦川牛肌卫星细胞的分离与鉴定(1)使用联合酶消法分离秦川牛肌卫星细胞,采用差速贴壁法纯化,观察卫星细胞在增殖过程中的形态变化,结果表明,分离的肌卫星细胞呈梭形,生长状态良好。(2)通过免疫荧光、Western Blotting和qPCR检测肌卫星细胞的标志基因,成肌分化液诱导肌卫星细胞分化。Pax7的免疫荧光显示纯化后的纯度达到94.27%;Western blotting和qPCR结果表明,肌卫星细胞处于静止期或增殖期;诱导分化的实验结果表明分离的肌卫星细胞具有较高的纯度和良好的成肌分化性能,可用于下一步的试验3.牛DGAT1、FABP4、PPARγ2过表达对细胞成脂分化的影响(1)过表达载体转染秦川牛骨骼肌细胞,提取细胞总RNA进行qPCR检测。qPCR检测结果表明过表达载体pEGFP-N1-DGAT1、pEGFP-N1-FABP4、pEGFP-N1-PPARγ2可以在骨骼肌中表达。(2)过表达载体转染肌卫星细胞后,qPCR显示PPARγ2过表达组的ACC表达显著高于DGAT1组和FABP组,FASN的表达量显著高于DGAT1组和FABP4组;PPARγ2过表达组的LPL表达显著低于DGAT1组和FABP4组。ELISA结果显示PPARγ2过表达组ACC的含量显著高于DGAT1组和FABP4组,而LPL的含量显著低于DGAT1组和FABP4组。表明PPARγ2调节脂肪代谢相关基因表达的能力优于DGAT1和FABP4。(3)过表达载体转染肌卫星细胞后,进行成脂诱导分化,通过油红O染色检测脂滴的形成。结果显示,PPARγ2过表达组油红O染色OD值显著高于DGAT1组和FABP4组。表明PPARγ2促进脂肪沉积的能力优于DGAT1和FABP4(4)过表达载体转染肌卫星细胞,检测甘油三酯含量和游离脂肪酸含量发现,PPARγ2过表达组甘油三酯浓度显著高于DGAT1组和FABP4组;游离脂肪酸浓度显著低于DGAT1组和FABP4组,即PPARγ2促进脂肪沉积的能力优于DGAT1和FABP4综上所述,本试验成功构建了三个不同与脂肪沉积有关的基因DGAT1、FABP4以及PPARγ2过表达载体,通过转染牛肌卫星细胞研究表明PPARγ2在肌肉中沉积脂肪能力最强。