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醇脱氢酶(ADHs,E.C.1.1.1.1)属于氧化还原酶,能以NAD(P)H为辅酶,催化醇与相应的醛、酮相互转化。该酶在醇类代谢途径中起重要作用,常具有高立体选择性和广泛底物谱,因而被普遍应用于医药研究、化工生产和食品领域。本论文对罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri DSM20016中的5种醇脱氢酶进行了克隆表达,并优化了诱导条件,研究了酶学性质,为其影响奶酪芳香气味的体内验证奠定了分子生物学基础。主要研究结果如下:(1)本文成功克隆了 5个来自L.reutreri DSM20016的醇脱氢酶基因(adh-1、adh-2、adh-3、adh-4和adh-5),分别连接到质粒 pRSFDuet-1 上,并在Escheria coli BL21(DE3)中表达。5 种 ADHs 预测分子量分别为 37.6kDa、37.8 kDa、35.8 kDa、36.0kDa 和39.0 kDa,其保守结构域分析显示这5种ADHs属于中链脱氢酶家族。经过酶活验证,发现5种ADHs对影响奶酪风味的庚醛均有一定活性。(2)本文优化了醇脱氢酶重组菌的诱导条件,得到重组菌的最适诱导条件:诱导初始菌体浓度OD600值为0.6,诱导温度为20℃,诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol·L-1,诱导后培养时间为16 h、摇床转速为200 r·min.1,在此条件下,对比优化前的E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ADH-1 菌株,酶活提高了 72%。(3)利用Ni+亲和层析对5种ADHs进行纯化,并研究其酶学性质。结果如下:最适反应 pH,ADH-1、ADH-3为5.0,ADH-2为6.0,ADH-4和ADH-5为7.0;最适反应温度,ADH-1 是 40℃,ADH-2和ADH-3 分别是 35℃和55℃,ADH-4和ADH-5是50℃。奶酪发酵时,核心温度可以达到40℃～50℃,且pH偏低,综上结果说明,部分醇脱氢酶比较容易适应发酵时的环境条件变化。(4)底物特异性实验显示,5种ADHs具有广泛的底物谱,能催化11种与奶酪风味相关的醛醇化合物。金属离子、EDTA实验中,1mM的Zn2+促进酶活,而EDTA、Ca2+、Fe2+和Cu2+抑制酶活,说明5种ADHs具有金属依赖性。动力学实验结果显示,ADH-1对庚醛的催化能力最强(Kn=4.59×102 μmol·L-1,Kcat/Kn=0.39×102s-1.mM-1),ADH-2 对丁醛的催化能力最强(Kn=0.13×102 μmol·L-1,Kcat/Kn=0.12×102 s-1.mM-1),ADH-3 和 ADH-5催化效率最佳的底物是3-甲基丁醛的(Kn=0.30×102 μmol·L-1,0.14×102 μmol.L-1,;Kca/Km=4.64 s-1.mM-1,0.24×102 s-1.mM-1),ADH-4 催化效率最佳的是己醛(Km=0.13×102μmol.L-1,Kcat/Km=0.18×102 s-1.mM-1)。