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目的:1.探讨食管鳞癌组织PD-L1表达与临床病理特征、放射敏感性以及预后之间的关系;2.研究食管癌细胞株Eca109经电离辐射后,PD-L1表达的时间-剂量效应关系;观察放射线联合PD-L1调控对细胞增殖、周期、凋亡和放射敏感性的影响,初步探讨影响放射敏感性的机制。方法:1.通过免疫组化检测食管鳞状细胞癌和正常食管粘膜中PD-L1表达,采用肿瘤细胞染色强度和阳性细胞比例进行计分来确认PD-L1在组织中反应强度,统计分析PD-L1表达与肿瘤长度、淋巴结转移、TNM分期、病理分级等临床病理特征、放射敏感性以及预后的相关性。2.使用RT-PCR和Western blotting检测不同剂量X线照射后食管癌细胞株Eca109中PD-L1 m RNA和蛋白表达水平,CCK-8检测食管癌细胞增殖情况,研究PD-L1时间-剂量效应关系,摸索后续研究最适照射剂量。3.利用RNAi技术调控食管癌中PD-L1表达,通过RT-PCR检测干扰前后食管癌细胞株中PD-L1 m RNA表达,CCK-8和FCM检测转染前后食管癌细胞株增殖和凋亡情况。并比较6Gy下Eca109组、Eca109-N组、Eca109-P组的细胞增殖、周期、凋亡和放射敏感性的影响,初步探讨影响放射敏感性的机制。结果:1.PD-L1表达与食管鳞癌的相关性1.1 PD-L1在食管鳞癌中表达免疫组化SP法验证:食管癌组织中PD-L1阳性表达率为56.7%(51/90)明显高于正常食管黏膜组织15.0%(3/20),差异具有统计学意义(P<0.05)。1.2 PD-L1表达与食管鳞癌临床病理特征的相关性PD-L1蛋白表达水平与食管鳞癌患者的年龄、性别、部位、最大直径、病变长度、周围组织侵犯、原发肿瘤分期、临床分期及原发肿瘤体积无显著相关性(P>0.05),与淋巴结转移有显著相关性(P<0.05)。1.3 PD-L1表达与放射敏感性的关系90例食管鳞癌放射治疗后3月内使用食管钡餐进行疗效评价,其中放射敏感组(CR+PR)68例,放射抗拒组(NR)22例。放射敏感组PD-L1阳性表达率63.2%(43/68)明显高于放射抗拒组39%(8/22),差异具有统计学意义(χ2=4.888,P<0.05)。1.4 PD-L1与接受根治性放疗的食管鳞癌患者的预后关系PD-L1表达阳性组3年无疾病生存率28.4%,阴性组是19.8%。而PD-L1阳性组3年总生存率是31.9%,阴性组是20.9%。经Kaplan-Meier单因素分析两组无疾病生存率(PFS)及总生存率(OS)差异均无统计学意义(P>0.05)。Cox比例风险模型多因素分析也发现PD-L1表达水平不是食管鳞癌的独立预后因素。2.不同剂量照射前后食管癌细胞株Eca109中PD-L1表达情况2.1 PD-L1在食管癌细胞株Eca109中的表达RT-PCR检测结果示,食管癌细胞株Eca109中PD-L1m RNA的表达水平(0.45±0.04)明显高于正常食管细胞HET-1A(0.25±0.01),差异具有统计学意义(P<0.05)。同时Western blotting也发现食管癌细胞株Eca109 PD-L1蛋白表达水平明显高于正常食管细胞HET-1A,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2照射前后食管癌细胞株Eca109中PD-L1表达情况与对照组相比,不同剂量照射食管癌Eca109细胞之后,PD-L1在m RNA和蛋白水平均明显增加(P<0.05),且随照射剂量增加而增加,均具有统计学意义。在3Gy照射后12h表达量达到峰值,而6Gy、9Gy照射后24h表达量达到峰值,随照射后时间延长,PD-L1表达量逐渐下降。2.3照射前后食管癌细胞株Eca109的增殖能力CCK8检测结果示,与未照射组相比,不同剂量照射组食管癌细胞的增殖水平在照射后不同时间点均下降(P<0.05),其中24h下降最为显著。3.RNAi技术调控PD-L1表达后对食管癌细胞株Eca109的影响3.1转染后食管癌细胞株Eca109中PD-L1表达RT-PCR检测结果显示,Eca109-P组细胞中PD-L1 m RNA表达较Eca109组和Eca109-N组分别下降了72.5%(1.02±0.03)和71.7%(0.99±0.03)(P<0.05),而Eca109-N组相比于Eca109组下降了3%(P>0.05),无统计学意义。3.2转染后对照射前后食管癌细胞增殖水平的影响转染后36h内各组细胞增殖水平无明显差异(P>0.05),36h时转染组细胞增殖水平低于Eca109组和Eca109-N组,差异具有统计学意义(P<0.05)。经6Gy照射后,各组细胞的增殖水平在照射后24h均下降(P<0.05),随着照射后时间延长,各组细胞的增殖水平逐渐增加,但Eca109-P组在36h、48h的增殖活力明显低于Eca109组和Eca109-N组(P<0.05)。3.3 PD-L1下调后对照射前后食管癌细胞周期的影响未照射Eca109组、Eca109-N组的细胞处于G0/G1期、G2/M期和S期比例未见明显差异(P>0.05),Eca109-P组G2/M期比例下降,S期比例上升(P<0.05)。经6Gy照射后各组细胞处于G0/G1期比例明显低于相应未照射组(P<0.05)。同时也观察到,照射后的各组细胞处于G2/M期比例高于相应未照射组(P<0.05),且照射后Eca109-P组细胞处于G0/G1期的比例明显高于Eca109组和Eca109-N组(P<0.05)。照射后的各组细胞处于S期比例未见明显明显变化。3.4转染后对照射前后食管癌细胞凋亡的影响转染后Eca109-P组细胞凋亡率高于Eca109组和Eca109-N组,差异具有统计学意义(P<0.05)。经6Gy照射后各组细胞凋亡率明显高于未照射组(P<0.05),且照射后Eca109-P组细胞凋亡率明显高于Eca109组和Eca109-N组(P<0.05)。结论:1.PD-L1在食管鳞癌组织中表达明显高于正常食管粘膜组织。PD-L1不能作为预测食管癌放疗患者预后的指标,可作为预测食管癌转移潜能和放射敏感性的生物标记物。2.食管癌Eca109细胞中PD-L1表达高于正常食管癌细胞,且PD-L1表达量随放射剂量增加而增加,存在时间剂量依赖性。3.RNAi技术沉默食管癌细胞中PD-L1表达后,细胞增殖能力下降,诱导细胞G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡,提示PD-L1可促进食管癌Eca109细胞增殖,诱导G0/G1期向G2/M期转化,增加增殖期细胞比例,从而增加对放射线的敏感性。