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猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪的一种高度传染性疾病,主要表现为妊娠母猪流产、死胎、胎儿木乃伊化等繁殖障碍和呼吸道症状。本研究通过参考GenBank中发表的PRRSV全基因序列,设计引物进行PRRSV Henan株全序列扩增。通过末端快速扩增试剂盒进行PRRSV5’端扩增获得5’端的精确序列。通过融合PCR的方法获得较大的基因片段,连接载体测序,获得PRRSV Henan株全基因序列。
从NCBI的PRRSV数据库中搜索并下载世界各地分离的代表性的PRRSV全基因组序列,将本研究的病毒的全基因组序列与其他代表毒株进行比较分析。结果表明,在全基因组相似性比对分析中,PRRSV Henan株与国内高致病性毒株(JXA1、HEB1、HUB2、HUN4和SY0608)相似性最高,分别为99.2％、99.2%、99.3%、99.3%和99.4%,与VR2332的相似性较低,为89.6%;与BJ-4的相似性为89.5%。PRRSV各开放阅读框核苷酸序列相似性分析中,Henan株与GDBY1、JXA1、HEB1、HUB2、HUN4和SY0608相似性在98.2%～100%。应用Clustalx软件分别对PRRSV的各个开放阅读框及其编码的氨基酸序列进行多序列比对,结果表明,3UTR核苷酸序列的67nt处发生了A→G的突变,该突变与HEB1、Lelystad Virus、SD0108相同。NSP1β氨基酸序列比对结果发现,与JXA1、HEB1、HUB2、HUN4和SY0608相比,两处位点的氨基酸发生了突变,分别为70 D→G、153 T→A。NSP2氨基酸序列比对结果显示,35位发生与HB→2相似的突变A→V,462位发生S→F的突变,504位与JXA1、GD、SY0608、HEB1、VR2332相比发生V→E的突变。NSP3氨基酸序列比对发现,与国内其他强毒株相比,在第8位发生与MN18A相似的突变F→L,第265位发生G→R突变,在404位发生S→G的突变。NSP4氨基酸序列比对发现,与国内其他强毒株相比,在第20位发生了M→I的突变。NSP5序列比对结果发现,与国内其他强毒株相比在第100位点发生Q→R的突变。NSP10氨基酸序列比对发现,与国内强毒株相比在189位发生了R→Q的突变,在327位发生了D→G的突变。结构蛋白氨基酸序列分析未发现有氨基酸的突变。在此基础上,应用MEGA4.0分析软件分别进行全基因、NSP2、ORF5、ORF7的系统发育分析,并采用常用的邻位相接法构建进化树。结果表明Henan毒株与美洲原型VR2332在遗传进化中同处于一个大的分支内,与变异强毒株HEB1、HUB2、HUN4、JXA1和SY0608相似性较高,均聚集于一个小的分支内,且与HEB1的遗传距离最近。
通过分析PRRSV Henan毒株基因序列,在不引入外来酶切位点的条件下,找出可以用于构建全基因克隆的酶切位点。对pVAX1载体的多克隆位点进行相应酶切位点改造并在Mcs两侧引入具有自我裂解功能的HamRz核酶及HdvRz核酶获得pVAXnew MCS载体。通过分段酶切连接的方法,将各个基因片段酶切连接pVAX neW MCS载体,获得包含PRRSV Henan株全基因序列的重组质粒pVABCDEF。将重组质粒pVABCDEF通过脂质体转染Marc-145细胞,并连续传代,观察细胞病变。采用间接免疫荧光实验与RT-PCR的方法进行鉴定。结果表明,脂质体转染Marc-145细胞在F2代起出现明显的细胞病变。通过RT-PCR与免疫荧光的方法鉴定,初步证实获得了具有感染性的PRRSV Henan株的恢复病毒。