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甘蔗是热带、亚热带主要的经济作物之一,全球60%的食糖均来至于甘蔗,我国的食糖更是有90%来自于甘蔗。随着能源短缺,甘蔗又被用作生产生物酒精的能源作物。甘蔗黄叶病是近20年来才发现的一种严重威胁甘蔗生产的世界性病毒病害,其发病率在10%—100%之间。从发现至今,该病已经蔓延到世界所有甘蔗生产国。我国也在2001年首次在广西出现了甘蔗黄叶病。甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV)是甘蔗黄叶病的病原物,属于黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polervirus),病毒粒子呈二十面对称体,无包膜,直径24-29 nm,电镜下观察外形呈六边形。基因组大小约5895-5898个核苷酸,由一条正单链RNA组成,有6个开放阅读框(ORF)。目前世界上报到的全基因组有16个,相关编码蛋白功能的研究报道较少。本文克隆获得了海南SCYLV分离物(SCYLV-HN1)的全基因组,分析了该分离物与已报道的其它分离物之间的亲缘关系,为确定海南SCYLV的来源提供理论依据。克隆SCYLV海南分离物的CP和PO基因,对其进行原核表达,并构建细菌双杂交诱饵质粒。为进一步研究CP和PO蛋白在病毒侵染和致病中的功能奠定基础。本文就海南地区具有典型甘蔗黄叶综合症的病样进行了以下三个方面的初步研究,其研究结论如下：1、成功克隆SCYLV-HN1分离物的基因组序列,该序全长5837 nt,包含6个开放阅读框。对该分离物的基因组分子进化进行了分析。其结果显示,海南分离物与BRA基因型的SCYLV具有很高的一致性,其比率达到了98.5%-99.0%。与我国的三株分离的一致性分别为98.6% (CHN-YL1 AM072752)、98.5% (CHN-FJ1 GU190159)和。86.7%(CHN-GD GU327735)。2、CP和PO基因的原核表达根据已发表SCYLV的CP和PO基因系列设计特异性引物,应用RT—PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的DNA片段。序列分析表明成功获得全长CP基因的开放阅读框包括591个核苷酸,编码196个氨基酸；全长PO基因的开放阅读框包含771个核苷酸,编码256个氨基酸。以pET32a(+)为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-CP和pET32a-PO。经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白PO是以包涵体形式的蛋白存在；融合表达蛋白CP主要是以可溶性蛋白的形式存在,但也有少量的CP融合蛋白以包涵体存在。CP融合蛋白大小约40 kDa,与CP开放阅读框的理论推算值21.735 kDa加上载体pET32a(+)自身蛋白约18 kDa相符；PO融合蛋白大小约45 kDa,与PO开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符。3、细菌双杂交诱饵质粒的构建与表达分析及自激活检测构建CP和PO细菌双杂交诱饵质粒后,可通过从甘蔗猎物文库中筛选与其具有相互作用的蛋白,从而对它们的功能进行研究。通过RT-PCR扩增CP和PO的编码区,将其插入带有λcI基因的pBT载体上,从而与λcI基因形成融合基因,建成重组质粒pBT-CP和pBT-PO,即诱饵质粒。将诱饵质粒转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan-2感受态细胞,在30℃培养条件下IPTG诱导重组融合蛋白表达。SDS-PAGE无法检测融合蛋白的表达情况,使用λcI蛋白的抗血清作为一抗,对表达产物作western blot免疫印迹检测,结果显示CP-λcI和PO-λcI融合蛋白均有表达。诱饵质粒分别同pTRG质粒共转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan-2,分别在含有3A-T和不含3A-T的平板上37℃培养,观察菌落生长情况,并与阴性对照比较。结果显示,诱饵质粒pBT-CP和pBT-PO均无自主活化作用,可用于下一步的文库筛选试验。