日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,可以引起人的脑炎现分布在于东南亚和太平洋地区大部分国家。猪是JEV最主要的增殖宿主,病毒经蚊-猪-蚊的循环传播。感染JEV的妊娠母猪会出现流产和死胎,公猪发生睾丸炎,直接影响猪群数量的扩大,造成巨大经济损失,因此有必要建立一种快速、敏感、特异的诊断方法。JEV的囊膜蛋白(E蛋白)结构域III(DIII)独立地在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样的结构,许多抗原中和表位都集中于这一结构域,可以作为较好的血清学诊断抗原。非结构蛋白NS1是JEV的主要抗原成分之一,可作为诊断抗原可以区分灭活苗免疫和自然感染抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达了JEV DIII和NS1,并用表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA检测方法。主要内容如下:参照GenBank发表的JEV SA 14-14-2株基因序列,设计针对DIII和NS1的引物,RT-PCR扩增DIII和NS1的基因片断,克隆到pMD18-T载体,再分别插入到原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)的T7启动子下游,建立pET-DIII和pET-NS1两个原核表达载体,将载体转入大肠杆菌BL21中诱导表达。Western-blot分析结果表明,表达的融合蛋白能与阳性血清发生特异性反应。表达产物经亲和层析法进行纯化,以其作为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗,初步建立了针对DIII和NS1抗体的间接ELISA检测方法。对ELISA各种反应条件进行了摸索,确定了最适工作条件,在此条件下两种方法P/N均大于5,DIII-ELISA S/P≥0.35判为阳性。DIII-ELISA与猪呼吸与繁殖综合征、猪细小病毒病及猪伪狂犬病的标准阳性血清均呈阴性反应,与猪日本脑炎病毒阳性血清呈阳性反应。批间、批内重复性试验结果变异系数均小于7%。用已建立的DIII-ELISA方法和微量细胞中和试验检测方法对280份猪血清样品进行平行检测,结果表明,DIII-ELISA方法的敏感性和特异性分别达到89.4%和91.8%,符合率达到87.9%。用建立的DIII-ELISA检测猪血清409份,检测时P/N均大于5,检出阳性142份。NS1-ELISA的平行检测结果表明与DIII-ELISA存在相关。由于血清背景不明,NS1-ELISA阴阳性判定及用来区分灭活苗和自然感染的效果有待进一步研究。