酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种优良的生物乙醇工业生产菌株。与以甘蔗或玉米淀粉为原料相比,酿酒酵母利用菊芋中的菊糖进行乙醇生产具有成本低、不占用粮食资源等优势。酿酒酵母中唯一能水解菊粉的内源蛋白是蔗糖转化酶Suc2,而Suc2的分泌表达水平直接影响着酿酒酵母利用菊糖生产乙醇的效率。目前,酿酒酵母Suc2分泌表达水平较低,严重阻碍了以菊粉为原料进行工业化生产乙醇的进程。有研究表明,蛋白质的分泌信号肽及酿酒酵母分泌途径中涉及膜泡运输的靶点蛋白能显著影响酿酒酵母中蛋白质的分泌水平。在此理论基础上,本论文对酿酒酵母BY4741中Suc2的分泌途径进行了改造优化。本工作首先从高尔基体至细胞膜膜泡运输过程中两个关键的酿酒酵母内源蛋白Sec1和Sso2出发,并利用酿酒酵母同源重组技术将Sec1和Sso2的自身启动子替换成组成型强启动子PGK1p,得到分别过表达Sec1、Sso2以及同时过表达Sec1和Sso2的重组菌株BYC1、BYO2、BYCO。随后将携带自身分泌信号肽和融合分泌信号肽MFα的Suc2表达载体pYC230-SUC2和pYC230-mSUC2电击转化至BY4741及三个重组菌株中,得到Suc2高水平表达菌株BYS、BYC1S、BYO2S、BYCOS和BYmS、BYC1mS、BYO2mS、BYCOmS。接下来对重组菌株中SEC1、SSO2以及SUC2的转录水平、Suc2的分泌水平和酶活力进行了考察。结果表明,BYC1mS和BYCOmS中SEC1的转录水平是BYm S的3倍以上,BYCOmS中SSO2的转录水平是BYm S的2.9倍。由以上结果可知,更换启动子能够提高SEC1、SSO2的表达水平。此外,利用Western blot对Suc2的分泌表达水平进行了分析,结果表明,过表达蛋白Sec1和同时过表达Sec1与Sso2能够显著提高Suc2在BY4741中的分泌表达水平。同时,在发酵48 h条件下,BYC1S和BYCOS的蔗糖酶酶活力相对于BYS分别提高了11%和55%,BYC1m S、BYO2m S、BYCOmS的蔗糖酶酶活力较BYC1S、BYO2S、BYCOS分别提高了65%、12%和26%。以上结果表明,分泌信号肽MFα能显著提高Suc2的分泌表达水平,且分泌信号肽和Sec1、Sso2过表达可能对Suc2存在共同辅助分泌的作用。最终,BYCOmS的厌氧发酵乙醇产量可达107.59±5.28 g/L。本工作所取得的成果将为理性改造酿酒酵母分泌途径,提高Suc2分泌水平提供理论依据,并为构建利用菊粉进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌打下基础。