【摘 要】
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海洋链霉菌能够产生许多具有生理活性的次生代谢产物,而多重耐药蛋白是在物质转运过程中发挥重要作用的一种蛋白,它与细菌耐药性的产生密切相关,Mar系统中的多重耐药蛋白包括以下几种:Mar R、Mar A、Mar B、Mar O和Mar C。目前Mar家族蛋白已经在大肠杆菌、福氏志贺菌、鼠疫耶尔森菌、沙门氏菌等多种细菌中被研究,但是海洋链霉菌中多重耐药蛋白相关的研究还比较少。本文通过从海洋链霉菌基因组D
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海洋链霉菌能够产生许多具有生理活性的次生代谢产物,而多重耐药蛋白是在物质转运过程中发挥重要作用的一种蛋白,它与细菌耐药性的产生密切相关,Mar系统中的多重耐药蛋白包括以下几种:Mar R、Mar A、Mar B、Mar O和Mar C。目前Mar家族蛋白已经在大肠杆菌、福氏志贺菌、鼠疫耶尔森菌、沙门氏菌等多种细菌中被研究,但是海洋链霉菌中多重耐药蛋白相关的研究还比较少。本文通过从海洋链霉菌基因组DNA中扩增获得一Mar C基因片段,并对其进行了生物信息学分析及异源表达,为更好的了解Mar蛋白转运机制及Mar C蛋白功能分析提供了依据,为新的海洋生物活性物质的研发提供帮助。具体结果如下:本文以大连市黑石礁海域筛选的海洋链霉菌Streptiomyces sp.L1总DNA为模板进行PCR扩增,通过采用不同的温度及不同的反应体系对反应条件进行优化,结果获取到一段约600 bp左右的序列。对目的片段回收后与克隆载体p MDTM-19T连接,之后转入到DH5α感受态细胞中,对重组质粒进行了鉴定并测序,结果表明目的片段长618 bp。生物信息学分析表明其ORF拟编码的蛋白分子量为12.04 k Da,理论等电点为6.67,消光系数为1.038,亲水性平均系数为0.846,为疏水性蛋白,不稳定系数为18.47;该Mar C拟表达蛋白不具有信号肽,容易发生磷酸化的丝氨酸残基（Ser）有4个,苏氨酸残基（Thr）有4个,容易发生糖基化的丝氨酸残基（Ser）有5个,苏氨酸残基（Thr）有3个,高级结构以α螺旋为主,为稳定性蛋白。系统发育树结果显示不同的链霉菌中多重耐药蛋白基因具有较近的进化关系,其中我们扩增获得的基因序列与Streptomyces sp.S063属于同一分支,亲缘关系近,证明我们扩增的基因序列为Mar C基因序列,将该质粒命名为p MDTM-19T-Mar C。将目的片段与p ET32a（+）连接后构建p ET32a（+）-Mar C重组表达质粒,转入BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG（0.5 mmol/L）诱导使Mar C蛋白表达。SDS-聚丙烯酰胺电泳结果分析显示Mar C能够表达出一个分子质量大约为27.00 k Da的蛋白,与我们在线分析预期的结果相符合,因此可以预测Mar C蛋白已经得到了表达。
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