研究背景和目的: 全球吸毒人数的持续增加，尤其是女性吸毒人数递增显著且趋于年轻化引起了国内外研究人员的关注。关于阿片类药物成瘾性、躯体依赖性、精神依赖性、药物耐受性以及其机体造成多系统、多脏器功能损害和改变的机理是不断研究和探索的课题。近几年来，人们更多的关注于阿片类药物对女性性腺轴所造成影响的研究，而对其靶器官是否有直接影响的研究相对较少。因此本课题在研究雌激素(ER)受体、孕激素受体(PR)以及骨钙素(BGP)存在于人成骨细胞的基础上，用吗啡干预体外培养的女性成骨细胞，观测成骨细胞ERmRNA、PRmRNA、BGPmRNA表达的变化，通过探讨外源性阿片类药物对成骨细胞的直接作用，为进一步寻求减少或阻断吗啡依赖对骨的负面影响提供一定的理论依据，进而为研究阿片类药物依赖和戒断症状的病因及治疗提供依据和思路。 材料与方法: 试验材料取自山西医科大学第一临床医院骨科15例女性(20-40岁)骨折病人手术时废弃的碎小骨组织，所有病例均排除先天性疾病、内分泌疾病、骨代谢性疾病、自身免疫病，以及半年内服用雌孕激素和糖皮质激素者。术中取松质骨1 cm×1 cm×1 cm，浸入培养液，4℃保存，术后2h用酶消化法进行分离，培养。 将培养出的成骨细胞通过茜素红染色、细胞碱性磷酸酶化学染色(Gomonri改良钙钴法)及逆转录聚合本酶链式反应(RT—PCR)进行鉴定；参照相关文献[43-46]将所培养的细胞分为6组，分别是对照组(空白对照)；吗啡组(单纯加入吗啡，终浓度分别为10-7mol·L-1、10-6mol·L-1、10-5 mol·L-1、10-4 mol·L-1)；吗啡＋纳洛酮组(提前加入纳洛酮孵育1h，再加入吗啡，二者的终浓度为10-5mol·L-1)。首先通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测各试验组在不同的时间内成骨细胞增殖情况，再采用RT—PCR法，利用样本与β—actin的灰度比值，计算出各试验组ERmRNA、PRmRNA、BGPmRNA的表达水平。 所有数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SAS9.0统计软件对MTT增殖试验结果进行一般混合效应模型分析；采用SPSS13.0统计软件对RT—PCR结果进行单因素方差分析和LSD检验，比较量效关系时用对数线性相关分析；以α=0.05为检验水准。 结果: (一)所培养的细胞呈贴壁生长，体积较大，呈带突起的三角形、长梭形、纺锤形、星形、不规则形等成骨细胞形态。细胞核呈椭圆形，含2-3个核仁，胞浆内可见黑色颗粒。传代后的细胞增殖较快，可见重叠生长的细胞逐渐形成细胞小结且随着胶原的分泌和钙盐的堆积，最后形成不透光的矿化结节。矿化结节经茜素红染色呈红色。细胞合成的碱性磷酸酶经改良的钙钴法(Gomonri法)染色呈棕黑色细微颗粒。RT—PCR法显示分离培养的细胞表达BGP mRNA。说明用酶消化法可方便地从成人骨组织中获得大量、高纯度的人成骨细胞(HOB)，并保持了其在体内的功能，可用于进一步的研究。 (二)结合MTT结果与成骨细胞的生长曲线表明，吗啡的浓度和生长时间对成骨细胞的增殖都有影响，在相同的时间点随着吗啡浓度的增加OD值减少(P＜0.001)，表明吗啡浓度越大对成骨细胞增殖的抑制作用越强；在不同的时间点里成骨细胞的增殖速度不同(P＜0.001)，尤其是在吗啡干预后的第1-2天的影响差异最大，随着时间的延长，时间曲线的变化率减小，表明吗啡对成骨细胞增殖的抑制作用减弱。 (三)RT—PCR结果显示：ERmRNA、PRmRNA、BGPmRNA和内参β—actin的基因产物分别在249bp、196bp、255bp、270bp处出现特异性扩增条带。不同浓度吗啡组的ERmRNA、PRmRNA、BGPmRNA表达分别与对照组及吗啡+纳洛酮组之间比较均有统计学意义(P＜0.001)且随着吗啡浓度的减小成骨细胞内ERmRNA、PRmRNA、BGPmRNA表达增加，二者之间呈负相关(r=-0.993，P＜0.001；r=-0.984，P＜0.001； r=-0.984，P＜0.001)。 结论: 1．用酶消化法可方便地从成人骨组织中获得大量、高纯度的HOB，并保持了其在体内的功能，可用于进一步的研究。 2．在细胞水平上，吗啡可直接抑制人成骨细胞的增殖；在分子水平上，吗啡可直接使女性成骨细胞ERmRNA、PRmRNA、BGPmRNA表达下降，且呈剂量依赖性下调。