昆虫的形态多样性在其生存繁衍过程中占据着重要地位。昆虫形态多样性的产生是其适应外部环境的需要,从本质上讲则是昆虫躯体发育过程中基因差异表达的结果。随着遗传学、发育生物学、分子生物学等生命科学的发展,人们越来越多的从分子水平上揭示昆虫形态多样性产生的根本原因。昆虫躯体模式的建立是一个极其复杂的过程,包含着不同层次的基因网络调控程序,其中同源异型基因（homeotic genes, Hox）的发现可以说是这一研究领域的里程碑。然而,Hox基因作为昆虫躯体模式发育的主调控基因,其重要性也暗示着调控作用机制的复杂性,除果蝇外,对其他昆虫Hox基因的研究仍然较少,尤其是囊括了主要农林害虫的鳞翅目。同时,已有的研究表明躯体发育相关基因的表达和作用机制在不同昆虫间存在着较大差异,说明了独立研究代表性昆虫的必然性与必要性。家蚕作为鳞翅目的重要模式,拥有丰富的遗传突变资源,又是遗传学传统实验动物之一,为形态发生的分子机制研究提供了良好的平台。本研究以3个突变基因位点不同,但表型相互联系的家蚕E群及类似突变为主要研究材料,解析其突变的分子基础,并以此为切入点,鉴定参与家蚕躯体模式建立的有关重要基因,并对其相关功能进行研究,通过3个突变之间的相互联系,综合研究相关基因在家蚕躯体发育过程中的作用及调控机制。获得的主要研究结果如下：1.家蚕胸部突变Wes的分子解析及候选基因的功能研究楔形眼纹（Wedge eye-spot, Wes）突变位于家蚕第6连锁群24.3cM位点,为单基因显性遗传,其杂合体（Wes/+Wes）幼虫眼状纹只有中间部分,并特化为狭窄的倒三角形,其名称即由此而来。Wes突变纯合体（Wes/Wes）胚胎后期致死,其形态表现为胸节愈合,第1对胸足异位至头部下方,并发生同源异型转化为触角形态,第2、3对胸足也均向触角发生不同程度的转化。Wes突变成虫的前后翅表现为小翅或畸形翅。利用244个BC1M个体对Wes突变位点进行定位分析,将家蚕Wes突变的候选基因锁定为BmAntp基因。经克隆测序发现,在Wes突变体中BmAntp基因的第3外显子内部插入了1570bp的non-LTR反转录转座子序列,破坏了BmAntp基因的同源异型结构域。此外,在Wes突变纯合体中,发现BmAntp基因含有正常与突变两种转录本,其中正常转录本的表达量明显较低,而异常转录本则相对较高。我们推测Wes纯合体突变表型的产生是由BmAntp基因功能的缺失导致的,其中正常转录本的量不足以维持其正常功能。与此相反,在Wes突变杂合体幼虫中,BmAntp基因正常转录本的表达量则显著高于野生型中的表达量,表明Wes突变幼虫的楔形眼纹表型可能是由BmAntp基因的过量表达所致。BmAntp基因正常转录本的表达量在突变中之所以升高,我们推测是因为BmAntp基因的表达存在一种负反馈调节机制,而BmAntp蛋白功能的丧失破坏了这种平衡机制。综上所述,研究结果表明BmAntp基因的精确表达是家蚕胸节发育所必需的。对家蚕BmAntp基因的干涉结果显示,在正常胚胎中一定程度沉默BmAntp基因后,胸节发生愈合,胸足不能正常发育,这与Wes突变纯合体胚胎的表型一致,暗示BmAntp基因在家蚕胸部分节过程中起着重要作用。在dsBmAntp-RNAi处理后的家蚕胚胎中出现胸足发育不全,结合Wes纯合体中出现类触角附肢,我们推测BmAntp基因既参与家蚕胸足的发育,同时也是胸足形态决定所必须的。此外,Wes突变成虫的前后翅与野生型的相比表现为小翅或畸形翅,定量检测结果显示,BmAntp基因在突变前后翅中的表达量与野生型相比均有显著升高,暗示在家蚕中BmAntp基因可能参与翅的发育及形态形成。2.家蚕腹部突变ECs-l的分子解析家蚕ECs-l突变表现为第2腹节生过剩腹足,第3腹节生过剩半月纹,第5腹节星状纹正常。由于家蚕E群突变（6-22.1cM）中的过剩半月纹过剩肢（supernumerary crescents and legs, ECs）突变除第5腹节缺星状纹外,其余表型均与Ecs-l突变相似,故而我们将该新突变命名为ECs-l （supernumerary crescents andlegs-like）突变。利用1605个BC1M个体对ECs-l突变基因进行精细定位,我们将ECs-l突变位点锁定在Bmabd-A和BmAbd-B基因间约68kb的区域。候选区域内不含任何蛋白编码基因,仅有一个非编码RNA, miR-iab-4,但是通过对野生型大造和ECs-l突变中miR-iab-4序列的分析,并没有发现二者之间存在核苷酸的变化。此外,在候选区域内,我们共获得9个多态性明显的标记,且这些标记在1605个定位群体中均与EC--l位点共分离。利用18个家蚕地方品系对这9个多态标记进行特异性检测发现,仅标记P39在ECs-l突变中是特异的。标记P39位于miR-iab-4上游约7.5kb处,通过对其扩增的序列进行分析,我们发现与其他品系相比在ECs-l突变中有约210bp的缺失,且该序列在家蚕基因组中为单拷贝,也非转座元件,我们推测该序列可能作为Bmabd-A基因或miR-iab-4的调控元件存在,在基因调控中起着重要作用。本研究中将ECs-l突变的候选区域定位在Bmabd-A基因上游约11kb处,因此将Bmabd-A基因作为ECs-l突变的候选基因进行研究。对Bmabd-A基因mRNA与蛋白的表达分析结果均显示其在ECs-l突变中显著升高,对Bmabd-A基因的组织定位结果也表明Bmabd-A蛋白过量表达至A2体节,说明ECs-l突变中A2体节过剩肢的产生是由Bmabd-A基因的异位表达所致。因此,我们推测Bmabd-A基因可以促进家蚕腹足的形成与发育。3.家蚕无胸足突变ap的基因定位研究无胸足（apodal, ap）突变位于家蚕第3连锁群22.3cM位点,表现为胸足退化,爬行、食桑困难,雌蛾不育。通过对ap突变雌蛾生殖系统的解剖,我们确定了导致其不育的原因为交配囊退化,同时通过对雌蛾造卵量的调查、卵孔观察及孤雌生殖实验分别排除了雌蛾造卵能力、卵孔及卵内容物方面存在的可能缺陷因素。由于ap突变雌蛾不育,我们选择来自于F1代自交产生的F2代中的ap突变个体用于基因定位。通过384个F2代ap突变个体的基因分型实验,我们将ap突变的候选区域锁定在标记A60和A73之间,与标记A54和A85不发生交换,该区域内有两个预测基因BGIBMGA008843和BGIBMGA008844。经分析发现,这两个基因实际上应为一个基因,Bmsob基因。该基因属于odd skipped基因家族,参与一系列的胚胎发育及躯体模式建立过程。利用RACE技术我们获得了Bmsob基因在野生型与ap突变中的cDNA全长序列,分别为1923bp和1924bp,其中蛋白质编码区长1311bp,编码436个氨基酸,5’非编码区均长85bp,3’非编码区分别长527bp和528bp,均有2个外显子。在ORF框内,Bmsob基因在野生型和ap突变中有15处单碱基突变,其中13个为同义突变,2个为错义突变（P→A,S→P）。另外,在ap突变中Bmsob基因的3’非编码区有8处单碱基突变及1个碱基的插入。对Bmsob蛋白结构预测发现其是编码含5个C2H2型锌指结构的锌指蛋白,属于转录因子。对家蚕sob基因的时空表达模式分析发现,Bmsob基因在家蚕幼虫生殖腺中表达,在吐丝期第3天和蛹1天高量表达,这个时期是从幼虫到蛹变态发育的关键阶段,同时也是生殖腺发育的重要阶段,暗示Bmsob基因在家蚕生殖腺的发育过程中起着重要作用。此外,对Bmsob基因在翅发育过程中的表达模式分析结果显示,Bmsob基因的表达量随着翅原基的发育,表达量逐渐增加,其中5龄末期表达量最高,暗示Bmsob基因还参与了家蚕翅的发育与形成。通过qRT-PCR对Bmsob基因在胚胎期和蛹1天的表达量分析显示,Bmso6基因在ap突变中的表达量与野生型中相比显著降低,且近似于沉默。我们发现在野生型与突变中Bmso6基因的启动子区域存在序列差异,并通过双荧光素酶报告系统分别检测了Bmsob基因在野生型与突变中的启动子活性,结果表明突变中Bmso6基因的启动子活性明显降低,因此我们推测该基因启动子区域的序列变异可能是导致其表达量降低的重要原因。4.候选基因间的相互调控关系研究根据对Wes和ECs-l突变的研究结果及Hox基因的功能,我们推测ap突变的三种突变表型（无胸足、畸形翅和交配囊退化）可能与家蚕Hox基因中的BmAntp BmUUbx和BmAbd-B基因有关。对这三个基因在野生型与ap突变中的表达量检测结果显示,它们均上调表达。其中Wes突变与ap突变一样,成虫翅均表现为小翅或畸形翅,同时BmAntp基因也均表现为过量表达。因此,我们将Bmsob作为调控Hox基因精确表达的上游基因进行研究。首先我们经过原核表达且纯化了Bmsob蛋白,通过EMSA实验验证Bmsob蛋白与BmAntp、BmUbx和BmAbd-B基因的相互作用。结果表明,Bmsob蛋白能够与BmUbx基因直接结合。继之,为了验证Bmso6基因是否对Hox基因存在间接的调控作用,我们利用基因芯片对在野生型与ap突变中存在差异表达的基因进行筛选,通过分析发现BmDsp基因可能在其中起着重要作用。通过EMSA实验也证实了Bmsob蛋白确实能够与BmDsp基因结合。原核表达且纯化BmDsp蛋白后,我们同时分析了BmDsp蛋白与BmPc、BmAntp、BmUbx和BmAbd-B基因的结合能力,结果表明BmDsp蛋白与它们均能够结合。综合以上结果,我们得出以下调控关系：BmDsp基因能够促进Hox基因的表达,Bmsob基因既能够直接抑制Hox基因的表达,又能够通过抑制BmDsp和BmPc等基因间接的抑制Hox基因的表达。我们推测该调控网络在家蚕躯体发育过程中对Hox基因的精确表达起着重要作用。