【摘 要】
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DECB-6P（Calf blood hexapeptide）源于注射用小牛血去蛋白提取物（Deproteinized Extract of Calf Blood for Injection,DECB）,通过肽合成制备,其分子量为628.40 Da。本论文在本课题组前期进行DECB-6P制备及活性研究的基础上进行了应用研究:首先通过DECB-6P水凝胶的制备、质量标准建立及稳定性研究,确定水凝胶运
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DECB-6P（Calf blood hexapeptide）源于注射用小牛血去蛋白提取物（Deproteinized Extract of Calf Blood for Injection,DECB）,通过肽合成制备,其分子量为628.40 Da。本论文在本课题组前期进行DECB-6P制备及活性研究的基础上进行了应用研究:首先通过DECB-6P水凝胶的制备、质量标准建立及稳定性研究,确定水凝胶运输方式及保存条件;其次通过对DECB-6P水凝胶的药物释放及体外生物学性能的研究,确定DECB-6P水凝胶用于伤口愈合治疗的可用性和安全性;最后通过建立小鼠全皮层伤口模型,确定DECB-6P水凝胶促进伤口愈合作用及分子机制,具体包括以下几方面:1、DECB-6P水凝胶制备、质量标准建立及稳定性研究首先通过正交实验及响应面方法进行水凝胶配方优化,确定辅料配方为:卡波姆-940,甘油,三乙醇胺的最佳配比分别为0.6%,10%,1.0%;根据最佳配比制备DECB-6P水凝胶,其外观澄清透明,质地均匀细腻无颗粒,pH值、粘度适宜,涂展性好,常温下保持胶状,不干涸或者液化。然后通过HPLC法建立DECB-6P水凝胶的质量标准,确定DECB-6P水凝胶中有效成分DECB-6P含量不得低于194.5μM。最后通过测定水凝胶物理和化学稳定性,确定成品水凝胶运输方式及保存条件为常温运输、4℃和25℃条件为最佳保存条件。2、DECB-6P水凝胶药物释放及体外生物学性能研究水凝胶的药物释放曲线和透皮率结果显示水凝胶的最大药物释放度为90.32%,最高透过率为87.12%,说明水凝胶具有良好的药物释放能力和透皮效果;MTT和划痕实验结果显示,DECB-6P促进HSF和HaCaT的增殖率分别为118.18%和129.41%,两种细胞在24 h的迁移率分别达到86.58%和93.24%,说明DECB-6P可以通过促进HSF和HaCaT的增殖和迁移促进伤口愈合;抑菌实验表明DECB-6P水凝胶可以通过减少伤口处细菌（大肠杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌）的生物侵袭来防止伤口感染,从而达到更好的促进伤口愈合的作用。最后通过测定发现DECB-6P水凝胶具有良好细胞相容性和无任何皮肤刺激性,确定DECB-6P水凝胶的应用安全性。3、DECB-6P水凝胶促进伤口愈合作用及分子机制研究本论文创建了小鼠皮肤全皮层创伤模型,对DECB-6P水凝胶促进伤口愈合作用及分子机制进行了研究。首先通过小鼠皮肤的伤口愈合率发现,给药后第七天DECB-6P水凝胶组伤口愈合率达到84.34%,阳性药（DECB水凝胶）组伤口愈合率为74.95%,均高于对照（基质）组伤口愈合率为59.87%。给药后第14天,DECB-6P水凝胶组的小鼠伤口几乎全部愈合,伤口愈合率最高为96.25%,阳性药组愈合率为91.66%,对照组的愈合率为87.38%。说明DECB-6P水凝胶能够明显加快小鼠伤口的愈合速度。通过H＆E染色、免疫组化、Masson染色及Western Blot进一步分析DECB-6P水凝胶对小鼠创伤组织内部的修复及分子作用机制。H＆E结果显示:DECB-6P水凝胶可以有效促进炎症期向增殖期转化,促进伤口愈合的进程。免疫组化结果显示,给药后第7天,DECB-6P水凝胶组新生血管数明显高于对照（基质）组,DECB-6P水凝胶组新生血管数达到114个,而对照（基质）组新生血管数为55个。给药后第14天DECB-6P水凝胶组伤口愈合进入重塑阶段,新生血管消退,而对照组伤口愈合仍处于增殖期,其新生血管数量高于给药组,以上结果说明DECB-6P水凝胶可以通过促进新生血管形成新为伤口区域提供营养,加速伤口愈合。Masson染色结果显示DECB-6P水凝胶组出现更多的胶原沉积,胶原占比达到95.37%,而阳性药（DECB水凝胶）组为76.12%,对照（基质）组为73.96%,同时DECB-6P水凝胶组胶原蛋白分布均匀,更趋于完整化,说明DECB-6P水凝胶可以通过促进胶原蛋白的产生和沉积促进伤口愈合。Western Blot结果与免疫组化及Masson染色结果一致,进一步证明DECB-6P水凝胶可以通过促进新生血管的形成和胶原蛋白的产生促进伤口愈合,同时DECB-6P水凝胶通过减少伤口愈合后期CollagenⅠ和CollagenⅢ的比例,有效预防疤痕的形成。本论文通过以上研究,确定DECB-6P水凝胶具有促进小鼠全皮层伤口愈合的作用,为DECB-6P经皮局部给药治疗伤口愈合的开发奠定理论基础。
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