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目的: 血管衰老是衰老的重要组成部分,直接影响各种心血管疾病发生的阈值和严重度,是心血管疾病的独立危险因子。白藜芦醇是目前公认的抗衰老中药单体,作用机制与Sirtl、eNOS等有关。何首乌作为传统抗衰老中药,目前研究证明是通过抗氧化作用而达到抗衰老。比较后发现何首乌有效活性成分二苯乙烯苷结构与白藜芦醇相似,本研究的目的是探索二苯乙烯苷抗血管衰老的作用及相应机制。 方法: 1.12周龄SHR雄性大鼠适应性喂养一周后,每天灌胃给药何首乌二苯乙烯苷提取物(HSW-Extract,HSWE)94.3mg/kg(二苯乙烯苷的含量为53%,50mg/kg),白藜芦醇100mg/kg;尾套法每周测定大鼠血压值;给药12周后处理大鼠,测大鼠体重、颈动脉压、心电图平均周期速率(BPM)、血流平均值。灌胃前后收集尿液,测尿中肌酐、蛋白及NOx含量。 2.取出胸主动脉进行β-半乳糖苷酶衰老染色;提取主动脉蛋白通过免疫印迹法测定p53、p53K373乙酰化蛋白的表达;提取主动脉RNA,RT-PCR测定Sirt1、Sirt3、Sirt6、eNOS、PAI-1mRNA变化;主动脉冰冻切片后,通过免疫荧光染色方法观察p-γH2AX、PAI-1;主动脉蛋白经Smad3抗体沉降后,测定乙酰化Smad3蛋白含量;将主动脉DNA破碎为500bp左右的片段,Smad3抗体沉降,测定Smad3与PAI-1启动子结合的关系。 3.以过氧化氢处理HUVECs,造成细胞衰老模型,给药后β-半乳糖苷酶衰老染色验证药物作用;提取细胞蛋白,测定p53、p53K373乙酰化、PAI-1及Smad3乙酰化的表达。 4.向EA.hy926细胞转染eNOS质粒,测定luciferase活性,确定药物对eNOS影响。 5.转染Sirtl质粒入HEK293细胞中,用TGF-β1刺激后提取细胞蛋白,经Smad3免疫沉降后,测定其乙酰化程度。 6.Sirt1活性测定试剂盒测定药物对荧光标记的Sirtl酶活性的影响。 结果: 1.何首乌二苯乙烯苷提取物对SHR大鼠体重、血压、心电图平均周期速率没有影响,但是能够提高颈动脉血流量。大鼠尿肌酐含量给药前后均没有差异。给药前尿蛋白含量无差异,给药后含量降低;尿中NOx含量给药前无差异,给药后含量显著增高。 2.灌胃何首乌二苯乙烯苷提取物后大鼠主动脉β-半乳糖苷酶染色程度较对照组降低,p53、p53 K373乙酰化蛋白、乙酰化Smad3含量减少,Sirt1、Sirt3、Sirt6、eNOSmRNA表达增多,PAI-1mRNA减少,p-γH2AX、PAI-1荧光强度减弱,PAI-1启动子近端出现条带,且给药组条带较对照组弱。 3.衰老细胞在二苯乙烯苷单体孵育后β-半乳糖苷酶衰老染色程度轻,p53、p53 K373乙酰化蛋白、PAI-1、Smad3乙酰化蛋白的表达均降低。 4.二苯乙烯苷单体促进eNOSluciferase活性约为空白组3倍。 5.转染Sirtl质粒的HEK293细胞Smad3乙酰化程度降低。 6.二苯乙烯苷单体直接激活Sirtl酶活性,是空白组3倍。 结论: 何首乌二苯乙烯苷提取物能够延缓SHR血管和HUVECs的衰老进程,其主要活性成分为二苯乙烯苷,作用机制与阳性药白藜芦醇相似:增加长寿基因Sirt1、表达及活性,增加eNOS的基因表达,促进NO的生成,抑制衰老基因p53、PAI-1表达,降低H2AX磷酸化和Smad3的乙酰化。