光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种非常有发展前景的能诱导细胞凋亡和坏死的肿瘤治疗方法。光动力学的作用因素包括对光敏感的物质——光敏剂、光以及氧分子。光敏剂可以被病变靶组织选择性的吸收，在合适波长的光的激发下，通过能量的转换产生活性氧物质，进而造成对靶组织的损伤。血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)是一种新型的卟啉类光敏剂，并已在基础实验和临床试验中证明了它的高效性。但目前HMME-PDT对乳腺癌细胞作用的研究较少。本课题采用这种新型光敏剂血卟啉单甲醚，用波长为632.8nm的He-Ne激光照射，研究不同光敏剂剂量及不同激光照射剂量的光动力学作用对MCF-7的影响，用酶标仪检测HMME-PDT对MCF-7细胞的生长抑制率，用透射电镜、荧光显微镜、流式细胞仪等技术检测细胞凋亡的情况。方法：1．细胞抑制率检测先将传代培养的MCF-7细胞，以1×10~5/ml的浓度均匀接种于96孔培养板内，每孔100μl，用无血清的培养液培养24小时，使细胞周期同步化。然后加入不同终浓度的光敏剂在37℃避光孵育2小时，再用PBS洗3次，加入完全培养基，即刻进行激光照射。照光后将培养板放置在培养箱继续避光培养24小时，然后每孔加入10μ1 CellCountingKit8(CCK-8)，在37℃避光孵育3小时，用酶标仪检测每孔的吸光度。用处理组的吸光度与对照组吸光度相比较来表示各组的细胞抑制率。实验分为PDT组和对照组。PDT组共设5个光敏剂浓度，5μg/ml(A组)，10μg/ml(B组)、20μg/ml(C组)、40μg/ml(D组)、80μg/ml(E组)，每组用5个激光照射剂量进行照射，1.2J/cm~2(a组)、2.4J/cm~2(b组)、4.8J/cm~2(c组)、9.6J/cm~2(d组)、19.2J/cm~2(e组)。对照组分单纯光敏剂组(5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml)、单纯激光照射组(1.2J/cm~2，2.4J/cm~2，4.8J/cm~2，9.6J/cm~2，19.2J/cm~2)和空白对照组。每个处理组设4孔。2．形态学观察(透射电镜和荧光显微镜)体外传代培养的MCF-7接种于35mm培养皿，用无血清的培养液培养24小时使细胞周期同步化。PDT组加入10μg/ml的光敏剂HMME，激光照射能量密度为2.4J/cm~2时。空白对照组未加任何处理。光动力学作用后，再培养24小时，分别进行Hoechst 33342染色荧光显微镜观察和固定包埋切片电镜观察。3．流式细胞仪检测细胞凋亡率和坏死率体外培养的MCF-7均匀接种35mm培养皿，用无血清的培养液培养24小时使细胞周期同步化。PDT处理步骤同形态学观察。光动力学作用后，再培养24小时，收集各组细胞，上流式细胞仪检测细胞的凋亡率、坏死率和存活率。实验结论：1．单纯激光组照射组和单纯光敏剂组的吸光度与空白对照组比较，无统计学差异，即单纯激光照射或单纯光敏剂孵育对MCF-7的增殖无明显抑制作用。各PDT组的吸光度与空白对照组比较，有统计学差异，即当激光和光敏剂同时存在时，对MCF-7有生长有抑制作用。2．用不同浓度的血卟啉单甲醚(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)，以及不同剂量的632.8nm的激光(1.2J/cm~2、2.4J/cm~2、4.8J/cm~2、9.6 J/cm~2、19.2 J/cm~2)对人类乳腺癌细胞MCF-7进行光动力学处理，均可产生明显的抑制作用，抑制程度在一定范围内与光敏剂浓度和激光照射剂量呈正比关系。3．荧光显微镜和透射电镜观察和流式细胞仪检测结果表明血卟啉单甲醚可以诱导人体乳腺癌细胞MCF-7凋亡。4．对体外培养的MCF-7细胞，光敏剂HMME在浓度40μg/ml时，只需很小的激光剂量就可产生较高的细胞抑制率。当激光照射能量密度达到4.8J/cm~2就可在较低的光敏剂HMME剂量下对细胞产生较高的生长抑制作用。