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研究背景及目的运用生物信息学和分子生物学技术,开展日本血吸虫SLP和TCTP基因克隆及功能鉴定,对于深入了解SjSLP和SjTCTP的生物学特性及其疫苗或新药开发价值有重要意义.研究内容从日本血吸虫cDNA文库中扩增出SLP和TCTP的完整编码区.将其分别克隆入相应的原核和真核表达载体,运用DNA免疫技术,研究SjSLP基因的抗炎作用和SjTCTP基因抗攻击感染的保护性效果以及CpG作为DNA免疫佐剂的效果.研究方法1.根据已知的SjSLP和SjTCTP基因的cDNA序列设计特异性引物,从SjcDNA文库中扩增出SLP和TCTP基因的cDNA全长编码区.2.将两基因的cDNA编码区分别克隆入pET-30a、pcDNA3.0和pEGFP-N1载体,构建pET-SLP和pET-TCTP原核重组质粒,pcDNA3.0-TCTP、pEGFP-SLP和pEGFP-TCTP真核表达质粒.3.将pEGFP-SLP和pEGFP-TCTP真核表达质粒转染Chang Liver细胞,荧光显微镜下观察表达情况.4.以小鼠为动物模型,进行DNA免疫研究,研究分两部分实施:A.SLP基因的抗炎症实验,使用LPS进行真皮内注射,造成皮肤炎症的动物模型.实验分三组,a.pEGFP-SLP+LPS组,b.pEGFP-N1+LPS空质粒阳性对照组,c.DPBS阴性对照组.a组和b组分别在注射LPS的-72 h、-48 h、-24h,0h、24h、36h和72h注射质粒,在注射完毕的36 h后断颈法处死小鼠,取小鼠腹部皮肤lcm×lcm大小,分两部分,一份石蜡切片,镜下观察炎症情况;一份提取总mRNA,反转录观察SLP的表达情况.B.TCTP基因DNA免疫保护性实验,以CpG作为免疫佐剂,两次免疫后2W进行攻击感染,感染后45d剖杀小鼠,检获成虫和虫卵,小鼠肝脏送病理切片观察虫卵肉芽肿.在免疫前,感染前和剖杀前取血清.检测免疫小鼠血清中IFN-γ水平,初步观察DNA免疫的免疫应答类型;以减虫率和减卵率评价TCTP基因DNA免疫的保护性效果以及CpG作为免疫佐剂的效果.结论运用核酸免疫技术,观察了小鼠模型中SjSLP的抗皮肤炎症的效果和SjTCTP基因DNA免疫引起的免疫应答类型以及抗攻击感染的保护性效果.发现:1)SjSLP有减轻皮肤炎症的作用,具有潜在的抗炎药物开发价值.2)SjTCTP DNA免疫能诱导较明显的保护性Thl免疫应答,并具有一定的减虫和减卵效果,提示SjTCTP具有潜在的疫苗研究开发价值.3)CpG基序可以有效的诱导保护性Thl免疫应答,增强DNA免疫的效果,是一种有效的DNA免疫佐剂.