论文部分内容阅读
目的:研究microRNA let-7e对心肌细胞β1-肾上腺素受体(β1-adrenergicreceptor,β1-AR)表达的调控。 方法:⑴结扎Wistar大鼠冠状动脉左前降支,建立6小时和24小时急性心肌梗死模型,蛋白免疫印迹法检测心脏缺血区和非缺血区的β1-AR和β2-AR的蛋白表达。⑵microRNA芯片技术和定量逆转录-聚合酶链式反应(quantitativereverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测缺血心肌microRNA let-7家族各成员的表达水平。⑶利用分子克隆技术构建人类和大鼠的含有β1-AR mRNA3非翻译区(3-untranslated region,3UTR)的双荧光素酶报告质粒。⑷采用双荧光素酶报告基因检测let-7对β1-AR mRNA3UTR的靶向作用。⑸培养乳鼠原代心肌细胞,采用细胞瞬时转染技术将let-7e的拟似物、let-7e的抑制物(AMO-let-7e)和无关序列的阴性对照(Negative Control,NC)转染细胞,qRT-PCR检测let-7e和β1-AR mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法检测各组β1-AR蛋白的表达水平。 结果:①与正常组相比,急性心肌缺血6小时心肌β1-AR表达上调3.0±0.8倍(p<0.01),24小时缺血β1-AR表达上调4.0±0.4倍(p<0.01);但缺血心肌β2-AR表达水平明显下降,表明急性心肌梗死时β1-AR选择性的表达升高。②microRNA芯片结果显示心肌缺血24小时的心肌组织let-7a、c、d、e和i表达下调超过50%,qRT-PCR检测结果为6小时急性缺血后,let-7a下调44.6%±1.3%,let-7c为21.1%±1.5%,let-7d为69.3%±9.3%,let-7e为36.2%±10.9%,let-7i为46.9%±2.9%;24小时急性缺血后,let-7a表达下调41.6%±3.8%,let-7c为31.6%±2.9%,let-7d为28.6%±5.7%,let-7e为39.2%±5.5%,let-7i为51.3%±10.3%。③双荧光素酶报告基因结果表明let-7c、d或e可以降低含有ADRB1的3UTR质粒的荧光素酶活性,突变的let-7c、d或e对荧光素酶活性无影响,表明let-7对β1-AR基因ADRB1调节的特异性。④在乳鼠原代心肌细胞,过表达let-7e明显下调了β1-AR蛋白的表达,而AMO-let-7e上调β1-AR的表达,无关序列对β1-AR的表达无明显影响;以上各组β1-AR的mRNA水平无明显变化。 结论:大鼠急性心肌缺血时β1-AR表达上调,β2-AR表达下调;let-7e通过转录后翻译机制调控心肌细胞β1-AR蛋白的表达。