卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。超过70%的卵巢癌患者在确诊时已为晚期,5年生存率不足50%,术后复发及耐药仍是卵巢癌治疗的难题。卵巢癌中最常见的病理类型为浆液性卵巢癌（serous ovarian carcinoma,SOC）,约占卵巢癌的70%,其恶性程度高且预后差。因此,探索SOC发生发展的新分子靶点并阐明其调控机制,是目前亟待解决的问题。最近研究表明,RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）是肿瘤发生、发展的主要参与者,其表达和定位的改变通过增加癌基因的表达并降低抑癌基因的表达从而促进肿瘤的发生及发展。近年来,人们越来越关注RBP在肿瘤中的作用,研究表明RNA结合蛋白RBM39抑制剂有强效抗白血病的药理作用;在三阴性乳腺癌中,RNA结合蛋白YTHDF2可能为新的癌症药物靶标。所以,RBP有望成为癌症治疗的新靶点。我们利用生物信息学方法分析了在卵巢癌中异常表达并与预后密切相关的RNA结合蛋白,从中发现MEX3A在卵巢癌中异常高表达并与卵巢癌的临床预后密切相关。MEX3A是MEX3家族的成员之一,MEX3家族在哺乳动物细胞中广泛存在,其主要包括四个成员:MEX3A、MEX3B、MEX3C和MEX3D。MEX3A在生物调控过程中扮演多种角色。近期研究表明,MEX3A可促进多种恶性肿瘤的增殖和转移,且MEX3A高表达的肿瘤患者生存期普遍缩短,预后不良。然而,MEX3A在卵巢癌中的表达、生物学作用及相关调控机制尚未阐释清楚。本课题探讨了 MEX3A在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义以及生物学功能。通过对MEX3A下游靶基因的筛选鉴定,以及上游分子调控机制方面的研究探讨其促进浆液性卵巢癌发生发展的相关机制。具体研究内容包括以下三部分:1.MEX3A在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究2.MEX3A促进浆液性卵巢癌发生发展的下游调控机制的研究3.MEX3A在浆液性卵巢癌中异常高表达的调控机制的研究第一部分MEX3A在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究研究目的检测MEX3A在浆液性卵巢癌中的表达,揭示其与临床病理特征及预后的关系。探讨MEX3A对卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭等恶性生物学行为的影响。研究内容及方法利用 GEPIA（GeneExpression Profiling Interactive Analysis）、TCGA（The Cancer Genome Atlas）及 GTEX（Genotype-Tissue Expression）数据库分析 MEX3A 在浆液性卵巢癌中的表达。分析GTEX数据库中MEX3A在浆液性卵巢癌与正常卵巢和输卵管组织中的差异表达。通过TCGA及CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）数据库分析浆液性卵巢癌中MEX3A基因拷贝数变异情况,并分析MEX3A基因拷贝数与其mRNA表达的相关性。利用TCGA数据库分析卵巢癌不同分子亚型MEX3A的差异表达。通过qRT-PCR及Western blot分析MEX3A在高级别浆液性卵巢癌（High-grade serous ovarian carcinoma,HGSOC）与正常输卵管伞组织中mRNA和蛋白水平的差异表达。通过Kaplan-Meier Plotter评估MEX3A对卵巢癌患者临床预后的影响。我们利用免疫组化检测组织芯片HGSOC临床样本中MEX3A的表达,并分析其与临床参数及预后的关系。通过慢病毒转染构建了 MEX3A稳定敲减和过表达的卵巢癌细胞系,设计了两条小干扰（siRNA）对MEX3A的表达进行干扰。通过qRT-PCR及Western blot验证干扰和过表达效率。通过MTT、EdU、平板克隆及Transwell等功能实验研究MEX3A对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。我们将构建的MEX3A稳定敲减的HEY卵巢癌细胞系及对照组细胞系注射到雌性裸鼠腋窝皮下,约3周后待裸鼠腋下有肿瘤生长时在麻醉状态下脱颈法处死裸鼠,取出皮下移植瘤,计算肿瘤的体积并称重（每组n=6）。研究结果1.MEX3A在浆液性卵巢癌中高表达GEPIA及TCGA-GTEX数据库发现与正常输卵管（n=5）和卵巢组织（n=88）相比,MEX3A在HGSOC（n=426）中高表达。通过分析TCGA数据库四种卵巢癌分子分型（增殖型,n=135;间叶型,n=106;免疫反应型,n=108;未分化型,n=134）中MEX3A的差异表达,发现MEX3A在增殖型中表达最高,间叶型次之,这些结果表明MEX3A可能与卵巢癌的增殖和转移密切相关。TCGA数据分析显示10%的HGSOC样本中存在MEX3A基因拷贝数的扩增,且在卵巢癌组织和细胞系中MEX3A基因拷贝数的扩增与mRNA的表达均呈线性正相关。我们用qRT-PCR方法验证了 HGSOC组织（n=24）和正常输卵管伞组织（n=12）中MEX3A mRNA的表达,发现MEX3A在HGSOC组织中mRNA的表达高于正常输卵管伞组织。我们通过Western blot方法验证了 HGSOC组织（n=10）与正常输卵管伞组织（n=6）,以及输卵管上皮细胞系和卵巢癌细胞系中MEX3A蛋白的表达情况。结果发现发现HGSOC组织中MEX3A蛋白表达显著高于正常输卵管伞组织;A2780、HEY、SKOV3卵巢癌细胞中的MEX3A蛋白表达明显高于正常输卵管上皮FT187。2.MEX3A高表达与浆液性卵巢癌不良临床预后相关我们从齐鲁医院妇产科随访办公室获取了组织芯片中所有患者的临床信息及随访资料。通过组织芯片的免疫组化结果发现MEX3A在HGSOC组织中的表达主要集中在细胞核,且在HGSOC组织中的表达高于正常输卵管伞组织。其中HGSOC样本中MEX3A高表达组占62.16%（69/111）,而正常输卵管样本中MEX3A高表达组占32.35%（11/34）。通过生存分析发现MEX3A低表达HGSOC患者的总生存期明显长于MEX3A高表达患者（P＜0.01）。MEX3A高表达与患者的腹水量有关（P=0.014）,与患者的年龄（P=0.845）、血 CA125（P=0.256）、FIGO 分期（P=0.558）无关。3.MEX3A促进卵巢癌细胞体外的增殖、迁移及侵袭能力MTT结果显示:干扰MEX3A的表达后HEY、A2780及SKOV3卵巢癌细胞系的增殖能力较对照组均出现了明显下降,且在第3天以后较为显著。而过表达MEX3A后,HEY和A2780卵巢癌细胞系的增殖能力较对照组均出现了明显上升,且在第3-4天后最为显著。EdU结果显示,敲减MEX3A后HEY、SKOV3和A2780卵巢癌细胞中分裂增殖细胞比例均较对照组明显减少。平板克隆结果显示在A2780和SKOV3卵巢癌细胞系中干扰MEX3A表达后单克隆集落数量较对照组减少50%左右;HEY卵巢癌细胞系中干扰MEX3A表达后单克隆集落数量较对照组减少约70%。而过表达MEX3A后HEY和A2780卵巢癌细胞系单克隆集落数量较对照组明显增加。Transwell实验结果显示:干扰MEX3A后,HEY、A2780及SKOV3卵巢癌细胞穿透小室的细胞数明显减少;干扰MEX3A同样引起HEY、A2780及SKOV3卵巢癌细胞穿透铺有基质胶小室的细胞数明显减少。以上结果说明干扰MEX3A的表达会导致卵巢癌细胞系增殖、迁移及侵袭能力下降,而过表达MEX3A显著提高了卵巢癌细胞系的增殖、迁移及侵袭能力。4.MEX3A促进卵巢癌细胞雌性裸鼠体内成瘤能力裸鼠皮下成瘤实验结果显示,MEX3A基因敲减组肿瘤的平均体积较对照组缩小50%以上,同样MEX3A基因敲减组肿瘤的平均重量较对照组减少50%左右。这说明干扰MEX3A显著抑制卵巢癌细胞的肿瘤生长能力,导致肿瘤重量和体积减小。小结MEX3A在浆液性卵巢癌中高表达,与总生存期较差有关。MEX3A在浆液性卵巢癌中发挥癌基因的作用,促进浆液性卵巢癌的恶性生物学行为。第二部分MEX3A促进浆液性卵巢癌发生发展的下游调控机制的研究研究目的探究MEX3A在浆液性卵巢癌中发挥恶性生物学作用的下游靶基因,并揭示MEX3A调节下游靶基因的分子机制。研究内容及方法通过siRNA干扰A2780细胞MEX3A的表达,并验证干扰效率。通过RNA-seq分析干扰MEX3A后卵巢癌细胞的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。进一步分析干扰MEX3A后卵巢癌细胞发生变化的可变剪接事件。将干扰MEX3A后发生变化的可变剪接事件和DEGs进行联合分析并筛选出DEGs。利用TCGA卵巢癌数据库对筛选出的DEGs与MEX3A进行相关性分析,并利用TCGA-GTEX数据库分析卵巢癌、正常输卵管上皮和卵巢组织中的DEGs以获取下游靶基因。分析 TCGA-GTEX 及 CPTAC（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium）数据库中HGSOC和正常对照组织之间下游靶基因的mRNA和蛋白水平的差异表达。分析MEX3A和下游靶基因在HGSOC组织中表达的相关性。通过qRT-PCR和Western blot来评估干扰MEX3A后卵巢癌细胞下游靶基因mRNA和蛋白水平表达的变化。应用小干扰RNA（siRNA）来下调卵巢癌细胞中下游靶基因的表达,并通过qRT-PCR和Western blot来验证干扰效率。利用MTT增殖实验、平板克隆及Transwell实验验证下游靶基因对卵巢癌细胞的恶性生物学行为的影响。利用MTT、平板克隆、Transwell及裸鼠体内皮下成瘤等方法进行了拯救实验,进一步验证MEX3A是否是通过靶基因调控卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。通过Sashimi分析干扰MEX3A后下游靶基因mRNA出现的可变剪接事件。通过分析Ensembl数据库中下游靶基因的mRNA转录本,探究MEX3A在浆液性卵巢癌中对下游靶基因的调控机制。研究结果1.浆液性卵巢癌中MEX3A下游靶基因的筛选及鉴定利用RNA-seq结果筛选了 MEX3A下调后卵巢癌细胞出现的543个上调基因和712个下调基因。进一步分析了 MEX3A下调后卵巢癌细胞发生变化的可变剪接事件。将筛选出的可变剪接事件和MEX3A干扰后的差异表达基因（DEGs）进行联合分析确定了182个DEGs。利用TCGA卵巢癌数据库对182个DEGs与MEX3A进行相关性分析,得到 7 个与 MEX3A 表达呈正相关的 DEGs（CSNKE1、OBSL1、DNASE1、ZNF711、TIMELESS、SAMD11 和 BCL9）。通过 RNA-seq 分析 MEX3A 敲低后 7 个 DEGs 表达发生的变化,并利用TCGA-GTEX数据库分析HGSOC、正常卵巢和输卵管上皮组织中7个DEGs的差异表达,结果显示只有TIMELESS在HGSOC组织中高表达。因此我们考虑TIMELESS是MEX3A在卵巢癌中的下游靶点。2.TIMELESS在浆液性卵巢癌中高表达通过分析TCGA-GTEX数据库中HGSOC和正常对照组织（HGSOC,n=426;输卵管,n=5;卵巢,n=88）之间TIMELESS mRNA的差异表达,发现TIMELESS在HGSOC中的表达高于正常输卵管及卵巢组织。分析CPTAC卵巢癌数据库中77例HGSOC和17例正常卵巢组织的数据,结果显示HGSOC中TIMELESS蛋白的表达明显高于正常卵巢组织。通过分析TCGA数据库里489例HGSOC样本中MEX3A和TIMELESS之间的相关性,结果证实TIMELESS mRNA的表达与HGSOC组织中的MEX3A mRNA的表达呈正相关。利用两条小干扰RNA（siRNA）来下调卵巢癌细胞中MEX3A的表达,并通过qRT-PCR和Western blot来验证TIMELESS mRNA和蛋白水平的表达的变化。qRT-PCR结果显示在HEY和SKOV3卵巢癌细胞系中通过小干扰RNA敲减MEX3A的表达后TIMELESS mRNA 的表达下降 75%以上。Western blot 结果显示 HEY、A2780 和 SKOV3细胞系中干扰MEX3A后TIMELESS蛋白表达水平明显下降,这说明siRNA介导的MEX3A下调降低了 TIMELESS的mRNA和蛋白质表达水平。3.TIMELESS促进卵巢癌细胞体外的增殖、迁移及侵袭能力MTT结果显示,干扰TIMELESS的表达可抑制HEY、SKOV3和A2780卵巢癌细胞系的增殖能力。平板克隆结果显示干扰TIMELESS的表达会导致HEY、SKOV3和A2780卵巢癌细胞系克隆形成能力下降。Transwell实验结果显示:干扰TIMELESS后,HEY、A2780及SKOV3卵巢癌细胞穿透小室的细胞数明显减少。说明干扰TIMELESS可抑制卵巢癌细胞迁移及侵袭的能力。4.干扰TIMELESS削弱MEX3A促进卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力MTT实验结果显示MEX3A+siTIMELESS组和PCMV+siTIMELESS组与对照组相比在干扰TIMELESS后增殖能力明显下降。平板克隆结果显示与对照组相比,MEX3A+siTIMELESS组和PCMV+siTIMELESS组在干扰TIMELESS后单克隆集落数均明显减少。Transwell结果显示与对照组相比,MEX3A+siTIMELESS组和PCMV+siTIMELESS组在干扰TIMELESS后卵巢癌细胞穿透小室的细胞数明显减少。以上结果说明,干扰TIMELESS部分逆转了 MEX3A过表达促进卵巢癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的能力。5.干扰TIMELESS削弱MEX3A促进卵巢癌细胞裸鼠体内的成瘤能力裸鼠体内实验结果显示MEX3A+shTIMELESS组较MEX3A组的肿瘤体积及重量明显缩小;PCMV+shTIMELESS组较PCMV组肿瘤的体积及重量明显缩小。这说明TIMELESS敲减后裸鼠皮下肿瘤的体积及重量均较对照组明显缩小,干扰TIMELESS可以部分逆转MEX3A过表达对体内卵巢癌细胞成瘤能力的影响。6.MEX3A通过调控内含子的保留调节TIMELESS mRNA的表达通过对Ensembl数据库及RNA-seq结果进行分析显示,与编码蛋白质的转录本TIMELESS-201和TIMELESS-203相比,非编码蛋白质的TIMELESS-205转录本中在外显子23和24之间保留了内含子23。RT-PCR结果显示干扰MEX3A后编码蛋白质的转录本TIMELESS-201/203表达降低,非编码蛋白质的转录本TIMELESS-205表达增加。qRT-PCR同样显示干扰MEX3A后,非编码蛋白质转录本TIMELESS-205表达比例明显增加。保留内含子23的TIMELESS转录本可导致TIMELESS正常编码区包含提前终止密码子,这会破坏开放阅读框并引发无意义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay,NMD）。干扰NMD中的关键因子UPF1后,TIMELESS mRNA表达显著增加。NMD途径依赖于蛋白质的翻译,因此翻译抑制剂放线菌酮（Cycloheximide,CHX）会抑制NMD介导的mRNA降解。qRT-PCR结果显示CHX对NMD的抑制导致TIMELESS mRNA的相对表达增加。RIP-qPCR结果显示MEX3A蛋白可以与TIMELESS mRNA结合。小结TIMELESS在浆液性卵巢癌中高表达,MEX3A通过无意义介导的mRNA降解（NMD）方式调节TIMELESS mRNA的表达。MEX3A/TIMELESS轴促进了卵巢癌细胞的恶性生物学行为。第三部分MEX3A在浆液性卵巢癌中异常高表达的调控机制的研究研究目的本部分拟阐明MEX3A在浆液性卵巢癌中高表达的上游调控分子,探究上游调控分子对浆液性卵巢癌增殖、侵袭及迁移的影响,并验证上游调控分子对MEX3A在浆液性卵巢癌中生物学行为的影响。研究内容及方法使用 ENCORI（The Encyclopedia of RNAInteractomes）数据库预测可以与 MEX3A 3’-UTR结合的miRNA。从GSE47841下载了浆液性卵巢癌和正常卵巢上皮之间的差异表达的miRNA数据（logFC≤-1）。对上述数据集进行联合分析筛选出miRNA。通过qRT-PCR逐个验证这些miRNA过表达对MEX3A mRNA表达的影响,筛选出对MEX3A负调控的上游miRNA。通过qRT-PCR及Western blot验证卵巢癌细胞瞬时转染上游miRNA后MEX3A mRNA和蛋白的表达变化。通过数据库发现MEX3A的3’-UTR区域与上游miRNA的潜在结合位点。基于pmirGLO构建含有MEX3A结合位点的野生型质粒,通过删除种子序列将野生型潜在结合序列更改为突变型。通过双荧光素酶报告实验验证miRNA是否与MEX3A直接结合。MTT增殖实验、平板克隆及Transwell实验验证miRNA在卵巢癌中的生物学功能。通过慢病毒转染构建卵巢癌MEX3A过表达细胞系,在MEX3A过表达细胞系中瞬时转染miRNA,通过MTT、平板克隆及Transwell验证miRNA对MEX3A在卵巢癌中生物学功能的影响。研究结果1.MEX3A上游调控miRNA的筛选及鉴定使用ENCORI数据库预测了 272个miRNA可以与MEX3A 3’-UTR结合。从GSE47841下载了浆液性卵巢癌和正常卵巢上皮之间的差异表达的miRNA数据。对两组数据集进行联合分析确定了 7个miRNA,它们在卵巢癌中的表达下调,并且可能与MEX3A mRNA的3’-UTR结合。通过qRT-PCR逐个验证了 7个miRNA过表达对MEX3A mRNA表达的影响,发现仅有miR-532-5p对MEX3A的mRNA表达有负调控作用。通过qRT-PCR及Western blot实验发现卵巢癌细胞转染miR-532-5p mimics后MEX3A mRNA和蛋白的表达水平显著降低。2.双荧光素酶报告实验验证miR-532-5p可与MEX3A直接结合双荧光素酶报告基因检测结果显示:HEK293T细胞中与miR-532-5p mimics共转染的两种野生型报告质粒的荧光素酶活性明显降低,而与miR-532-5p mimics共转染的两种突变型报告质粒的荧光素酶活性没有明显降低。这表明miR-532-5p可特异性结合MEX3A 3’-UTR的两个结合位点,并在转录后水平抑制MEX3A基因的表达。3.miR-532-5p抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭体外MTT细胞增殖实验结果显示:SKOV3和A2780卵巢癌细胞系过表达miR-532-5p可使卵巢癌细胞的增殖能力明显减弱,尤其在第2-3天最为显著。平板克隆实验结果显示SKOV3和A2780卵巢癌细胞系过表达miR-532-5p后单克隆集落数较对照组明显降低。Transwell结果显示SKOV3和A2780卵巢癌细胞系过表达miR-532-5p后穿透小室的细胞数明显减少。以上结果表明,miR-532-5p可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。4.miR-532-5p可削弱MEX3A促进卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭的能力MTT实验结果显示MEX3A+miR-532-5p组和PCMV+miR-532-5p组与对照组相比在过表达miR-532-5p后增殖能力明显下降,且从第3天开始较为显著。平板克隆结果显示与对照组相比,MEX3A+miR-532-5p组和PCMV+miR-532-5p组在过表达miR-532-5p后单克隆集落数均明显减少。Transwell实验结果显示:与对照组相比,MEX3A+miR-532-5p组和PCMV+miR-532-5p组在过表达miR-532-5p后卵巢癌细胞穿透小室的细胞数明显减少。以上结果说明,miR-532-5p部分逆转了 MEX3A过表达对卵巢癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。小结miR-532-5p可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-532-5p可以与MEX3A直接结合并负调控MEX3A的表达及生物学功能。研究结论1.MEX3A在浆液性卵巢癌中高表达,与不良的临床预后相关,其促进浆液性卵巢癌的恶性生物学进展。2.MEX3A通过调节TIMELESS内含子的保留促进浆液性卵巢癌的发生及发展。3.在浆液性卵巢癌中miR-532-5p负调控MEX3A的表达及恶性生物学行为。本研究的创新之处1.发现了与浆液性卵巢癌发生发展密切相关的RNA结合蛋白,且证实了 MEX3A的高表达与患者不良预后相关。2.首次发现MEX3A通过无意义介导的mRNA降解（NMD）方式调节TIMELESS mRNA的表达以促进浆液性卵巢癌的发生发展。3.证实在浆液性卵巢癌中miR-532-5p可负调控MEX3A的表达,是MEX3A的上游调控分子。本研究的不足之处1.本研究缺乏MEX3A在卵巢癌细胞耐药方面的探究。2.尚未明确MEX3A结合RNA的基序（motif）,今后可利用eCLIP方法进一步明确MEX3A调控TIMELESS的分子机制。