多烯紫杉醇(Docetaxel,DTX)是一种由紫杉烷类化合物紫杉醇(Paclitaxel,PTX)经结构改造得到的具有广谱高效的抗肿瘤活性的半合成化合物,其治疗效果是紫杉醇的2-4倍,临床上,多烯紫杉醇在实体瘤如乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤和头、颈部肿瘤的治疗上发挥重要作用。但随着多烯紫杉醇在临床上使用的广泛,一些问题逐渐显现出来。首先,多烯紫杉醇在水中的溶解度极低(5-6μg/ml),因此不能均匀地分散在体液中,这使其很容易从体液循环中被清除。临床上常见的多烯紫杉醇制剂如泰索帝(?)(Taxotere(?))和多帕菲(?)(Duopafei(?))等主要使用乙醇等有机溶剂和非离子表面活性剂Tween-80对多烯紫杉醇进行增溶,然而有机溶剂和表面活性剂的使用会造成溶血反应和超敏反应等不良反应,严重降低了患者对制剂的耐受性。另外,多烯紫杉醇本身的毒副作用如肝损伤,中性粒细胞减少症等和由长期用药所导致的多药耐药性(Multi-drug resistance,MDR)也限制了多烯紫杉醇的广泛应用。因此,设计一种合适的多烯紫杉醇制剂,提高多烯紫杉醇的水溶性,降低多烯紫杉醇以及制剂辅料等带来的毒副作用,高效地将多烯紫杉醇输送至肿瘤组织,提高多烯紫杉醇的生物利用度及抑瘤能力是非常必要的。两亲性药物-载体结合物是由疏水性的药物和亲水性的载体经由活性基团的化学反应或特定的连接体共价连接而获得的两亲性结合物,在水溶液中可以自组装形成胶束以增溶难溶性药物。与传统的胶束相比,由两亲性的药物-载体结合物所形成的胶束药物渗漏率低,并且具有特殊理化性质的嵌段或化学键的引入可以赋予胶束独特的理化性质,但是共价结合降低了药物释放速率,使其一定时间内的累积释药量较低,无法达到理想的治疗效果。因此,本研究中,疏水性药物通过共价结合和非共价包载两种方式被封装在聚合物胶束中,当胶束聚集在肿瘤组织中时,此种载药方式既可以使药物通过自由扩散由胶束释放到肿瘤组织,快速达到抑瘤浓度;同时与载体材料结合的药物的缓释或控释可以使疗效得以持续,从而实现高效且长效的肿瘤治疗。硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)提取自哺乳动物的软骨组织,是一种生物源性的强亲水性糖胺聚糖,其基本结构单位为D-葡糖醛酸和硫酸化的N-乙酰-D-半乳糖胺通过β-1,3糖苷键连接形成的二糖单元,这些重复的二糖单元通过β-1,4糖苷键彼此相连形成具有多种聚合度的的高分子糖链。硫酸软骨素具有较强的生物相容性以及独特的理化性质,并且其分子中含有大量的活性基团,如氨基,羧基等,便于进行加工与修饰。因此,硫酸软骨素及其衍生物被视为一种理想的载体材料。本研究利用疏水性的多烯紫杉醇对水溶性硫酸软骨素进行结构修饰,制备基于硫酸软骨素的具有自组装行为的两亲性载体材料(CS-DTX)。另外,与正常组织相比,肿瘤组织处存在大量的还原性谷胱甘肽(Reductive glutathione,GSH),该物质可将分子内部的二硫键还原为巯基从而断裂二硫键,鉴于此,本研究中将二硫键引入胶束体系,制备氧化还原敏感的硫酸软骨素-多烯紫杉醇结合物胶束并以此包载多烯紫杉醇原料药,以提升多烯紫杉醇在水性介质中的溶解性及生物利用度,并使多烯紫杉醇浓集在在肿瘤组织,实现高效而持久的肿瘤治疗效果,降低毒副作用。本课题的研究内容主要包括以下几个方面:1.氧化还原敏感的两亲性硫酸软骨素-多烯紫杉醇结合物(CS-ss-DTX)的合成,结构表征及自组装行为考察:合成了含二硫键的硫酸软骨素-胱胺(Cystamine,Cys)结合物(CS-Cys)与羧基化的多烯紫杉醇(DTX-COOH)并成功将二者连接,制备了含二硫键的硫酸软骨素-多烯紫杉醇结合物(CS-ss-DTX),利用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR),质谱法(Mass spectrum,MS),核磁共振氢谱法(Hydrogen-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)等评估了中间产物CS-Cys,DTX-COOH以及最终产物CS-ss-DTX的结构,证明了目标产物的成功合成。通过计算核磁共振氢谱相关峰峰面积可以求得CS-ss-DTX结合物中DTX取代度约为11%,为了评估CS-ss-DTX在水溶液中的自组装行为,利用芘荧光探针法测定了 CS-ss-DTX的临界胶束浓度值(Critical micelle concentration,CMC),结果表明 CS-ss-DTX 结合物 CMC 值较小,为0.040μg/ml。2.包载DTX的氧化还原敏感的CS-ss-DTX胶束的制备及理化性质考察:利用透析法成功制备了包载DTX的CS-ss-DTX胶束,利用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定了 CS-ss-DTX 胶束中包载的DTX含量,经计算可知胶束中DTX总量约为16%,利用透射电镜法(Transmission electron microscope,TEM)观察了胶束的外观形态,利用动态激光粒度测定仪(Dynamic light scattering,DLS)测定了胶束的粒径分布以及zeta电位。结果表明所制得的胶束粒径分布较均匀,平均粒径(259.67±2.06)nm,zeta电位(-27±0.43)mV,通过对比胶束在非还原性环境和还原性环境中的粒径分布可以证明所制得的胶束具有氧化还原敏感性。利用透析法分别评估了包载DTX和未包载DTX的CS-ss-DTX胶束在含有还原剂二硫苏糖醇(D,L-dithiothreitol,DTT)和不含DTT的释放介质中的释药行为,结果表明在两种释放介质中包载DTX的胶束的累计释放量均高于未包载DTX的胶束(58.9%vs 26.8%,49.5%vs 19.2%),在含有DTT的释放介质中两种胶束DTX的累积释放量均高于不含DTT的释放介质(58.9%vs 49.5%,26.8%vs 19.2%),证明 了包载 DTX 的 CS-ss-DTX 胶束在很长一段时间内具有较高的累积释药量,并且具有氧化还原敏感的释药行为。3.CS-ss-DTX胶束的体外,体内抗肿瘤活性研究:利用人乳腺癌细胞MCF-7评估了 CS-ss-DTX胶束的体外抗肿瘤活性。由于DTX本身不具有荧光,将疏水性的荧光性物质香豆素-6(Coumarin-6,C-6)包载入CS-ss-DTX胶束,利用荧光显微镜法定性评估胶束的细胞摄取性能,结果表明,被MCF-7细胞所摄取的载C-6的CS-ss-DTX胶束的量高于游离C-6,说明CS-ss-DTX胶束可以聚集于肿瘤组织以充分发挥抑瘤效果。利用噻唑蓝染色法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)评估包载DTX的CS-ss-DTX胶束对MCF-7细胞的毒性,结果表明,胶束对MCF-7细胞系的细胞毒性远高于游离DTX。包载DTX的CS-ss-DTX胶束与MCF-7细胞系共同培养48h后,利用荧光显微镜可以观察到MCF-7细胞系的细胞核出现明显的破裂,并且细胞数目大幅降低,细胞生长受到抑制。以荷鼠黑色素瘤细胞B-16的雌性昆明种小鼠为模型动物评估包载DTX的CS-ss-DTX胶束的体内抑瘤活性,结果表明,与多烯紫杉醇溶液相比,载游离DTX的CS-ss-DTX胶束对小鼠黑色素瘤具有较好的抑制作用。