研究背景:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)的一种严重创伤,由于损伤后脊髓缺乏自身修复能力,脊髓功能的损害呈不可逆性改变,患者受伤后大多终身丧失劳动力,生活不能自理,造成沉重的家庭和社会负担。SCI目前临床治疗主要包括脊柱骨折脱位的复位固定、解除脊髓压迫、改善损伤处脊髓的血液供应、减少各种有害因子或自由基的释放以减少继发性损伤等。但至今仍然没在根本上解决受损后神经元的功能恢复和再生问题,SCI治疗效果依然很不理想。近年来,随着神经病理生理及神经发育学领域研究的不断深入,CNS可塑性及其再生修复能力的发现,使SCI后神经再生修复成为可能。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植修复SCI被认为是目前最有应用前景的治疗手段之一。NSCs可在脊髓损伤修复过程的多个方面起作用,包括替代受损细胞如神经元和少突胶质细胞:分泌促进神经再生的神经营养因子,保护神经元,减轻继发损伤;在脊髓损伤空洞区形成桥接引导神经再生;酶解胶质瘢痕,去除细胞碎片,调节免疫反应,修复脊髓中的非神经组织如血管等。尽管目前研究普遍认为,NSCs在神经系统损伤修复的治疗中具有广阔的应用前景,但由于来源和数量有限,NSCs用于临床治疗仍有诸多限制。如何获得大量的能发挥治疗作用的NSCs已成为很多研究人员致力研究的重要课题。NSCs的获得包括胚胎来源和成体来源两个途径。胚胎来源是指来源于早期胚胎或胚胎神经组织的NSCs,由于其一直备受伦理学的争议,又存在取材困难,移植免疫排斥的风险,故进入临床治疗应用的难度很大。成体来源的NSCs是指来源于成年神经组织或成年其他组织干细胞诱导分化而来的NSCs。成体神经组织源性NSCs可来源于包括从出生到成年神经组织的广泛区域,分布在脑室下区(subventricular zone,SVZ)、纹状体、海马齿状回、脊髓等。成体非神经组织源性NSCs来源于骨髓、脂肪、皮肤等组织。骨髓基质干细胞(bone marrow stroma cells,BMSCs)是骨髓中除造血干细胞外存在于骨髓基质中的多能干细胞。目前已证实,BMSCs在特定的培养条件下可分化成多种细胞,如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞和神经元及神经胶质细胞等,具有克隆样增殖特性。其具有可向神经细胞方向分化的潜能,成为SCI后细胞移植替代治疗理想的种子细胞来源之一,也是当前移植修复SCI的策略之一。最近研究表明,在脂肪组织中也存在一种多能基质细胞,具备向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经细胞分化的潜能,被称为脂肪源性基质干细胞(adiposetissue-derived stromal cells,ADSCs)。在体外经过适当条件的诱导,可分化成脂肪源性NSCs。由于脂肪细胞更容易获得,采集风险相对较小易为病人接受,并可进行自体移植,已逐渐为学术界所关注,成为干细胞移植治疗的一种新种子细胞来源。虽然采用各种不同来源干细胞移植研究都取得了较为肯定的神经修复效果,但对于不同来源干细胞的适用范围、疗效差异等却缺乏足够的关注和较系统的比较实验研究。特别是对于SCI,不同来源的NSCs移植后是否具有相同的修复治疗潜力,目前尚未明确。综上所述,本课题以应用性研究为目的,选取来源于同一SD大鼠成体中骨髓、脂肪和脑室下区(阳性对照)三个部位的组织,体外分离、诱导分化为不同组织来源的NSCs,并比较各组NSCs体外自我更新的能力;以流式细胞仪等方法检测细胞表型标记物、鉴定BMSCs和ADSCs,并通过细胞周期检测比较两者增殖分化潜能;通过免疫细胞化学检测三组细胞不同阶段β-微管蛋白(β-tubulin)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、半乳糖脑苷脂C(galactocerebroside C,GalC)表达情况;ELISA法定量检测体外培养各组NSCs的脑源性神经营养因子(brain derived neuronutrophic,BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)等神经营养因子的分泌水平。100只SD大鼠应用自由落体损伤模型装置致脊柱撞击伤;对三种不同组织来源的NSCs以5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记后分别移植入大鼠SCI部位;通过BBB评分比较各组NSCs修复SCI功能的效果;术后8周检测脊髓空洞率变化;通过免疫组织化学检测β-tubulin、GFAP和GalC表达情况,分析三组细胞在体内向神经元和胶质细胞分化的情况。通过以上实验,以SVZ-NSCs为阳性对照,试图从体内、体外两方面对比和评价来源于同一成体非神经组织来源(骨髓和脂肪)的NSCs与中枢神经组织来源(SVZ)的NSCs对大鼠SCI的治疗效果,为SCI选择合适的种子细胞进行移植治疗提供实验依据。第一部分:不同来源成体神经干细胞的获取及相关生物学特性比较目的:体外分别诱导分化来源于同一SD大鼠成体骨髓、脂肪和大脑三种组织的NSCs,比较和评价它们在体外自我更新、向神经元或神经胶质细胞分化的能力,通过对比三者体外分泌神经营养因子的能力,进一步评估和对比它们移植修复脊髓损伤的潜能。方法:选取来源于同一SD大鼠成体骨髓、脂肪和脑室下区(阳性对照)三个部位的组织,体外分别诱导分化为骨髓源性神经干细胞(bone marrow stromalcell-derived neural stem cells,BM-NSCs)、脂肪源性神经干细胞(adipose tissuestromal cells-derived neural stem cells,AD-NSCs)和脑室下区源性神经干细胞(subventricular zone-derived neural stem cells,SVZ-NSCs),比较三组NSCs的自我更新和分化情况;流式细胞仪检测CD29、CD34、CD43和CD90等细胞表型标记物的表达,鉴定BM-NSCs和AD-NSCs的分化情况,并通过细胞周期检测比较两者的体外增殖潜能;应用免疫细胞化学方法检测巢蛋白(Nestin)、β-tubulin、GFAP和GalC四种细胞表面标记物的表达;并用Western blot方法进一步验证免疫细胞化学的结果,比较和评价它们向神经元和胶质细胞分化、增殖的能力;ELISA法定量检测体外培养三种组织来源NSCs的BDNF和NGF等神经营养因子蛋白水平,通过对比三者分泌神经营养因子的能力进一步评估它们移植修复脊髓挫伤的潜能,为SCI损伤临床干细胞移植治疗寻求适合的种子细胞提供体外实验数据。结果:三种组织来源基质细胞形成的神经球(即NSCs球,neurosphere)从外形观察无明显差异;但体外扩增率BM-NSCs和AD-NSCs不如SVZ-NSCs,观察到第20天,AD-NSCs(52.40±8.53)和BM-NSCs(35.60±6.54)神经球的倍增数目都显著低于SVZ-NSCs(83.80±8.10),而AD-NSCs要高于BM-NSCs;神经球形成阶段,SVZ-NSCs组的Nestin阳性率(84.41±6.18)明显高于BM-NSCs组(69.18±7.33)和AD-NSCs组(74.24±5.86);相比之下,AD-NSCs组又要高于BM-NSCs组;神经球分化后,三组细胞Nestin阳性表达都明显下降,分别为28.32±2.89、31.30±2.76和31.18±4.04。无论在神经球形成还是分化阶段,免疫细胞化学结果均显示,BM-NSCs组(2.06±0.75和28.22±6.41)和AD-NSCs组(1.10±0.50和26.82±4.87)β-tubulin表达阳性率均低于SVZ-NSs组(14.00±3.18和36.28±3.66),GFAP、GalC表达各组间表达无差异。由此提示,BM-NSCs和AD-NSCs体外向神经元分化的潜能低于SVZ-NSCs,而体外向胶质细胞分化的能力三组无差异,Western blot在蛋白水平也支持这一结果。同时,ELISA检测结果表明,三组细胞都能检测出BDNF和NGF分泌,但BM-NSCs组(22.82±4.43和44.96±8.81)和AD-NSCs组(45.78±8.82和62.38±13.99)明显低于SVZ-NSCs组(103.85±8.28和117.64±14.85);BM-NSCs组和AD-NSCs组相比较,尽管两组的营养因子分泌水平无统计学差异,但仍可看出AD-NSCs组BDNF和NGF的水平均高于BM-NSCs组。结论:体外实验证实,BM-NSCs和AD-NSCs与SVZ-NSCs一样都具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能,都能够分泌SCI修复所必需的神经营养因子。虽然三种不同组织来源的神经球从外形观察无差异,但无论在增殖能力、向神经细胞终极分化的能力和分泌神经营养因子的能力等方面,BM-NSCs和AD-NSCs均逊于中枢神经组织来源的SVZ-NSCs;BM-NSCs与AD-NSCs之间比较,又以后者具较明显优势。第二部分:不同来源成体神经干细胞移体内植修复大鼠脊髓损伤作用的比较目的:在体外实验的基础上,体内移植BrdU标记的各组NSCs,观测它们对自由落体SCI模型大鼠的修复作用,进一步评价和比较三种组织来源的NSCs对大鼠SCI的治疗效果,为SCI损伤的临床干细胞移植治疗寻求适合的种子细胞提供体内实验数据。方法:选取来源于同一SD大鼠成体中骨髓、脂肪和大脑(阳性对照)的三个部位的组织,诱导分化为不同组织来源的NSCs。移植前,将BrdU以10μmol/L终浓度加入培养液中,以标记各组待移植的干细胞;100只成年SD大鼠应用自由落体损伤模型装置获得脊柱损伤,模型制备成功1周后,采用完全随机数字表法分成5组:SVZ-NSs组、AD-NSs组、BM-NSs组、生理盐水组每组24只,假手术对照组4只,取各组标记好的NSCs(浓度为10~7个/ml)60μl,通过立体定位手术分别移植入大鼠SCI部位,于移植后不同时间点通过BBB评分比较修复SCI功能的效果;术后8周,计算各组脊髓空洞率;免疫组织化学检测各组NSCs在体内向神经元和胶质细胞分化的情况。结果:与生理盐水对照组比较,三种不同组织来源NSCs处理组BBB评分在2～8周表现出早期增值,9周以后的评分增值明显。移植后1周,免疫组化检测示各组SCI组织都能检测到β-tubulin、GFAP和GalC阳性表达细胞,提示各组都有不同比例的干细胞向神经元和神经胶质细胞分化。虽然各组之间BrdU/β-tubulin+、BrdU/GFAP+和BrdU/GalC+双标记细胞数差异均不大,无统计学差异,但从实验结果图片上可以看出,SVZ-NSCs组三种阳性细胞的比例(分别为1.31±1.10、1.12±0.93和53.24±6.27)都略高于AD-NSs组(分别为0.59±0.38、0.87±0.35和48.20±5.70)和BM-NSs组(分别为0.61±0.33、0.60±0.44和50.70±5.59);到术后8周,各组均只检测到少量BrdU/β-tubulin+和BrdU/GFAP+细胞。检测5组大鼠移植术后8周脊髓空洞大小,AD-NSs组(6.76±1.93)和BM-NSs组(7.10±1.33)与生理盐水(13.40±2.14)对照组和SVZ-NSCs组(10.86±2.64)相比,空洞率有明显的减少;而尽管SVZ-NSCs组取得明显功能恢复,但空洞率与生理盐水对照组相比没有明显差异。结论:植入来源于成体大鼠骨髓和脂肪组织来源的NSCs与来源于大脑的NSCs一样都可以在一定程度上提高SCI后运动功能恢复,SVZ-NSCs治疗组作为神经组织源NSCs增殖分化及移植治疗SCI的阳性对照组,SCI大鼠运动功能恢复要比其他处理组疗效显著。移植到体内后,AD-NSs、BM-NSs和SVZ-NSCs都有不同比例的细胞向神经元和胶质细胞分化。虽然免疫组化阳性细胞计数方面各组没有统计学差异,但是由实验结果可以提示,AD-NSs组和BM-NSs组细胞在体内向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的能力仍略低于SVZ-NSCs组。移植术后8周,以脊髓空洞率检测脊髓修复情况,结果却显示AD-NSs组(6.76±1.93)和BM-NSs组(7.10±1.33)均优于SVZ-NSCs组(10.86±2.64)。提示SCI后的大体组织结构修复情况(空洞率变化)和功能修复之间没有必然联系,细胞桥架作用可能不是功能修复的主要机制。全文小结:本课题的体外实验及体内实验结果均表明,来源于成体骨髓和脂肪的NSCs,与来源于脑组织(阳性对照)的NSCs一样,均可作为移植用种子细胞对脊髓损伤发挥修复作用,虽然脑源性NSCs比骨髓源性和脂肪源性NSCs具有更强的SCI修复能力,然而受伦理学限制,SVZ-NSCs目前尚无法应用于临床治疗;BM-NSCs与AD-NSCs则由于均可来源于自体、不涉及免疫排斥和伦理道德等问题,成为适用于干细胞移植治疗的理想的种子细胞;相比之下,AD-NsCs由于来源更广泛,取材相对更方便,细胞本身也相对有更强的自我更新及分化能力,因而相比其他组织来源的成体NSCs(BM-NSCs)可能是更好的选择。