论文部分内容阅读
根据Genbank中猪巨细胞病毒DPOL基因序列设计了扩增片段大小为579bp的引物P1/P2，建立了检测猪巨细胞病毒PCR方法。引物P1/P2从PCMV阳性DNA模板中扩增出特异性条带的最低DNA含量为10-2 ng/mL。PCR产物经测序比对，发现与NCBI中已发表的猪巨细胞病毒OF-1株序列(AF268041)的同源性为99％。用该方法对全国11个省市地区猪场的100份临床样品进行了检测。结果有33份样品检测出阳性，阳性率为33％。
应用PCR方法，从郑州、福建、浙江金华和宁波猪肺脏中分别扩增出四段PCMV gB基因，并将其分别克隆入pMD18-T载体，经蓝白斑筛选和PCR鉴定，将阳性克隆进行序列分析并构建系统进化树。序列分析表明，其gB基因全长为2580 bp，编码860个氨基酸，与PCMV其他序列相比，其同源性在96.1％～99.7％，与β疱疹病毒亚科中其他常见毒株同源性在25.9％～38.1％:推导的氨基酸序列，有11个半胱氨酸，17个潜在N-糖基化位点，其裂解位点是RYKR;系统进化树分析发现，推导的氨基酸序列出现两个分支，而且来自上述四个地区PCMV gB糖蛋白氨基酸序列处在不同的分支中。
根据已发表的NB PCMV gB基因序列设计1对引物.扩增引物上下游分别带有BamHI、XhoI酶切位点。PCR获得目的片段，并将其克隆到pMD18-T载体。用相同的限制性内切酶酶切阳性重组质粒和表达载体pGEX-6P-1后，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体pGEX-gB，转化宿主菌DH5α，经酶切和PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序证明目的基因以正确的阅读框插入了表达载体。将构建好的阳性表达质粒转化至表达宿主BL21(DE3)，IPTG诱导表达。收集菌液进行SDS-PAGE电泳，验证了重组蛋白在48KD处获得表达。Western-blotting分析重组蛋白可以特异性的与PCMV血清反应。该研究为建立PCMV的血清学诊断方法奠定了基础。