溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性、复发性的结肠炎症性疾病,在众多治疗UC的药物中,乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）被认为是一种潜在的有效药物,但如何实现LF的高效靶向递送一直是重大挑战。因此,开发一种可口服的乳铁蛋白药物靶向递送系统具有重大的应用前景。家蚕是一种重要的经济昆虫,其商业价值主要来源于分泌的蚕丝蛋白。近年来,蚕丝蛋白因具有优异的力学性能和生物相容性,被认为是一种良好的高分子生物材料。蚕丝由内层的丝素和外层的丝胶包裹而成。其中,丝胶蛋白占蚕丝蛋白的25%左右,富含羟基、羧基的极性侧链有利于与其它聚合物交联混合使用,不需要苛刻的反应条件,丝胶蛋白还具有良好的亲水性、生物相容性和生物降解性,但丝胶蛋白具有无定形和胶状结构,通过乙醇诱导,可以使α-螺旋和无规卷曲的构象转变为高度结晶的β-折叠而形成稳定的结构。因此丝胶蛋白被认为是一种理想的药物递送系统。此外,蚕丝由基因编码合成,可通过遗传操作在蚕丝特异表达药物、酶和受体等功能蛋白从而生产功能化蚕丝。考虑到乳铁蛋白在UC治疗中的应用及丝胶作为药物载体的潜力,本研究利用家蚕丝腺生物反应器在蚕丝中高效表达重组人乳铁蛋白（recombinant human lactoferrin,rhLF）,一方面解决rhLF药物蛋白来源的问题,另一方面通过丝胶蛋白（SS）实现递送rhLF的目的,并制备乳铁蛋白丝胶纳米微球（rhLF-SS-NP）用于治疗葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型,为UC治疗提供家蚕合成的新型蚕丝素材。取得如下研究结果:一、构建rhLF蚕丝家蚕实用种品系为提高rhLF的产量,并适应实际生产需要,首先利用课题组先前构建的rhLF蚕丝基础实验品系,与家蚕实用种绵茧品系进行杂交,后代进行自交,以此构建rhLF蚕丝实用种品系。杂交后选取茧型大的个体进行蛋白含量检测,再选取表达量高的个体进行自交,得到乳铁蛋白蚕丝家蚕实用品系。对茧层进行统计,结果发现:与原始品系相比,rhLF蚕丝家蚕实用品系的茧层重显著提高,并且外源蛋白含量提高了一倍。二、乳铁蛋白-丝胶纳米微球的制备与表征为了更多地提取丝胶蛋白,使用8 M浓度的尿素溶液提取含有乳铁蛋白蚕丝的丝胶和野生型蚕丝丝胶,经透析除去尿素后得到丝胶水溶液。为了保持rhLF的生物学活性,利用无水乙醇温和的诱导丝胶由无规则卷曲转变为β-折叠。将制备的丝胶水溶液通过蠕动泵,以100μL/min流速逐滴滴加至无水乙醇中进行诱导,诱导完成后转移至平皿中置于超净工作台干燥,最后用去离子水重悬收集丝胶纳米微球,获得了乳铁蛋白丝胶纳米微球（rhLF-SS-NP）和野生型丝胶纳米微球（WTSS-NP）。随后,将制备的SS-NP经SEM和TEM扫描观察结构呈球形,FITR结果显示两种SS-NP具有相似的二级结构,其中β-折叠含量最高,说明结构稳定。动态光散射法测定WT-SS-NP和rhLF-SS-NP径分别为123.30 nm（多分散指数,PDI=0.168）和147.25 nm（PDI=0.144）,粒径小有助于细胞的吸收。分析了rhLFSS-NP的释放特征,发现rhLF释放的速率与p H值无关,约56%的rhLF在最初4小时内释放。当在p H值大于5.5时,SS-NP的电动电位变为负电荷,提示制备的SS-NP可与带正电荷的炎症部分进行特异结合。三、rhLF-SS-NP生物相容性检测对制备材料的生物毒性进行评估。首先,将SS-NP与NIH/3T3细胞共培养24h,AO/EB染色结果显示无明显细胞死亡,表明SS-NP具有良好的生物相容性。随后,通过急性毒性试验检测SS-NP的毒性,按照最大剂量（1.25 g/千克体重）给小鼠灌胃SS-NP,以生理盐水（S组）作为对照。在14天的观察期内,没有小鼠死亡或出现异常行为,所有小鼠的身体生长趋势正常。器官指数结果显示,S组、rhLFSS-NP和WT-SS-NP组之间没有显著差异。此外,还进行了血常规、部分肝肾功能测试,治疗组之间没有显著差异。以上结果初步证明SS-NP没有毒性。四、rhLF-SS-NP的rhLF吸收和体内降解检测为探讨rhLF-SS-NP是否能提高rhLF的摄取效率,将同等剂量的rhLF-SS-NP和乳铁蛋白水溶液（rhLF-STD）与小鼠巨噬细胞（raw264.7）细胞共培养12 h,rhLF-SS-NP组在2 h后细胞中乳铁蛋白的浓度高于对照组且不断升高,而对照组中rhLF的含量逐渐降低,表明rhLF能逐渐被有效地释放和吸收,SS-NP材料能有效地促进细胞对rhLF的吸收,提高rhLF的利用效率。为进一步检测rhLF-SS-NP颗粒在结肠中的吸收情况,在特定时间点（3、6、12、24和48 h）灌胃rhLF-SS-NP颗粒,以含有相同浓度的rhLF-STD溶液作为对照,SS-NP组rhLF在各个时间点均明显存在,rhLF-STD组的荧光信号在6和12 h增强,但与rhLF-SS-NP相比,rhLF-STD组的荧光信号明显较弱,表明rhLF-SS-NP确实提高了rhLF的吸收效率。利用活体成像系统检测NP的降解情况,在灌胃后1h,小鼠胃、肠、盲肠、结肠组织中rhLF-SS-NP浓度升高,并持续12 h,24 h后仍观察到rhLF-SS-NP颗粒在胃和结肠中的存在,这为rhLF的释放和吸收提供了足够的时间。五、rhLF-SS-NP的活性评价研究SS-NP的体外抗炎活性,将WT-SS-NP、rhLF-SS-NP和rhLF-STD与经LPS处理的raw264.7细胞共培养,结果显示rhLF-SS-NP和rhLF-STD组,细胞上清中TNF-α、IL6和IL12这些促炎因子明显减少,提示rhLF-SS-NP能有效抑制LPS诱导的促炎因子的产生。为了评估其体内治疗效果,除对照组外,其余小鼠均灌胃葡聚糖硫酸纳（DSS）加饮用水建立急性结肠炎模型,同时每日分别口服生理盐水、WT-SS-NP、rhLF-SS-NP和rhLF-STD溶液。实验结果显示在所有DSS诱导的结肠炎小鼠组中,rhLF-SS-NP治疗组的疾病活动指数（DAI）最低,结肠缩短情况明显减轻。在形态上表现为结肠组织（S组）表现为柱状和杯状细胞破坏,免疫细胞聚集,而rhLF-SS-NP治疗组疾病严重程度显著降低,组织学评分与之一致。与S和WT-SS-NP组相比,rhLF-SS-NP组小鼠结肠MPO活性显著降低,IL2和IL6促炎因子水平降低,免疫荧光结果显示有更多的p65蛋白进入结肠组织细胞核,rhLF-SS-NP组处理后,p65荧光信号明显,但荧光信号基本出现在细胞核外,提示抑制NF-κb过度活化的作用靶点,这些结果表明rhLF-SS-NP能够有效治疗结肠炎。综上所述:SS-NP能够靶向运输乳铁蛋白,并具有良好的rhLF释放性能。这些具有良好生物相容性的rhLF-SS-NP能有效促进rhLF的吸收和利用,抑制NF-κB过度活化的作用靶点,对DSS诱导的结肠炎有良好的治疗作用。