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脓毒症是生物机体对感染反应的失控引起危及生命的器官功能障碍。在中国,脓毒症在ICU和全院的死亡率分别为28.7%和33.5%。尽管随着医疗质量的提高,脓毒症的死亡率略有下降,但发病率却升高,再次门诊治疗的脓毒症患者数量在增加。脓毒症引起的心功能不全是最为常见的并发症,发病率达40%~60%。大多数脓毒症患者发生心肌损伤与其早期死亡率以及出院后心血管事件的发病率独立相关。脓毒症患者出院1年内致死率达41.7%,1年以上致死率达33.4%,脓毒症导致的心肌损伤是致死的独立因素。目前在中国,严重脓毒症患者平均的住院花费是$11,390±$11,455,每人每日的平均费用是$502±$401,其高死亡率和高花费日益引起人们的重视。脓毒症引起的心肌线粒体损伤和线粒体功能障碍是心肌损伤和心功能障碍的关键因素。线粒体自噬被证实是改善线粒体损伤提高线粒体功能的有效途径。但靶向调控线粒体自噬改善脓毒性心肌线粒体损伤的研究,鲜有报道。米诺环素(minocycline,Min)是一种抗生素,在缺血的心肌细胞中比正常的心肌细胞更易于集聚,能够显著改善心肌缺血再灌注诱导的心肌损伤。Min在多种病理条件和多种细胞中被证实为有效的自噬诱导剂。但,Min是否能够诱导心肌粒体自噬改善线粒体损伤救治脓毒症引起的心肌损伤和心功能障碍,并未见报道。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)在自噬调节中被证实是关键效应物。不同环境条件下m TOR在细胞的生理学中发挥重要作用,协调细胞生长。研究也证实了,Min通过调控Akt/m TOR抑制卵巢肿瘤的生长。在心脏中,心肌组织广泛表达m TOR。但是,Akt/m TOR信号通路是否参与Min诱导心肌线粒体自噬发挥减轻脓毒症引起的心肌损伤和心功能障碍并不清楚。综上所述,本研究分别从整体动物和细胞水平探讨Min诱导心肌线粒体自噬对脓毒症心肌线粒体损伤的影响以及Akt/m TOR信号通路在其中的作用,为救治脓毒症心肌损伤和心功能障碍提供新的思路,以及为Min临床转化治疗脓毒症心功能障碍的研究提供基础研究的证据。【目的】1.构建盲肠穿孔结扎(Cecal ligation puncture,CLP)诱导的脓毒症动物模型,探索Min治疗脓毒症小鼠的适宜剂量。2.在CLP诱导的脓毒症小鼠中,探索Min是否诱导脓毒性心肌线粒体自噬及该效应对脓毒症诱导的心肌线粒体损伤的影响。3.探索Min诱导心肌自噬对CLP诱导的小鼠心功能障碍和生存率的影响。4.构建脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的原代心肌细胞脓毒症模型,探索Min治疗原代心肌细胞脓毒症的适宜剂量。5.离体实验探索Min是否诱导脓毒性心肌细胞自噬及该效应对LPS诱导的心肌细胞损伤的影响。6.探索Min是否靶向调节Akt/m TOR信号通路介导LPS诱导的原代心肌细胞自噬。【研究方法】1.构建CLP诱导的脓毒症小鼠模型,sham假手术作为脓毒症模型对照。2.构建LPS诱导的原代心肌细胞脓毒症模型。原代心肌细胞分离后给予不同剂量的LPS(0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml),通过评估凋亡指数和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的水平验证细胞脓毒症模型。探索最适的LPS诱导细胞脓毒症的剂量。实验随机分为以下4组:A.对照组:Contorl;B.0.1μg/ml LPS干预组:LPS-0.1;C.1μg/ml LPS干预组:LPS-1;D.10μg/ml LPS干预组:LPS-10。3.给予不同剂量的Min(25 mg/kg,50 mg/kg,100 mg/kg)在CLP后1 h、25 h、49 h连续3次腹腔注射,观察其对脓毒症小鼠7-d生存率和血清中肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)水平的影响。对照组给予生理盐水(normal saline,NS)。探索最适的Min治疗脓毒症的剂量。实验随机分为以下5组:A.对照组:Sham+NS;B.模型组:CLP+NS;C.25 mg/kg Mine治疗组:CLP+Min-25;D.50 mg/kg Mine治疗组:CLP+Min-50;E.100 mg/kg Min治疗组:CLP+Min-100。4.给予不同剂量(30 mg/kg,60 mg/kg)的自噬抑制剂3甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)于Min治疗前30 min腹腔注射,观察其对Min治疗脓毒性小鼠7-d生存率和血清中c Tn I的影响。探索最适的3MA逆转Min治疗脓毒症的剂量。实验随机分为以下5组:A.对照组:Sham+NS;B.模型组:CLP+NS;C.Min治疗组:CLP+Min;D.30mg/kg 3MA干预组:CLP+3MA-30+Min;E.60mg/kg 3MA干预组:CLP+3MA-60+Min。5.给予不同剂量的Min(8μg/ml,80μg/ml)在LPS诱导后1 h,通过评估凋亡指数和乳酸脱氢酶LDH水平观察其对LPS诱导的心肌细胞损伤的影响。对照组给予磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)。探索最适的Min治疗细胞脓毒症的剂量。实验随机分为以下4组:A.对照组:Contorl;B.模型组:LPS+PBS;C.8μg/ml Min治疗组:LPS+Min-8;D.80μg/ml Min治疗组:LPS+Min-80。6.给予不同剂量的3MA(10μm,40μm)在Min治疗前30 min,通过评估凋亡指数和LDH水平观察其对Min治疗LPS诱导的心肌细胞损伤的影响。探索最适的3MA逆转Min治疗细胞脓毒症的剂量。实验随机分为以下5组:A.对照组:Contorl;B.模型组:LPS+PBS;C.Min治疗组:LPS+Min;D.10μm 3MA干预组:LPS+3MA-10+Min;E.40μm 3MA干预组:LPS+3MA-40+Min。7.探索Min诱导脓毒症小鼠线粒体自噬后对线粒体损伤、心肌损伤、心功能障碍,以及7-d生存率的影响。实验随机分为以下5组:A.对照组:Sham+NS;B.模型组:CLP+NS;C.Min治疗组:CLP+Min;D.3MA干预组:CLP+3MA+Min;E.3MA干预对照组:CLP+3MA。8.探索Min对LPS诱导的原代心肌细胞自噬、线粒体损伤、心肌细胞损伤的影响及相关机制研究。实验随机分为以下5组:A.对照组:Contorl,B.模型组:LPS+PBS,C.Min治疗组:LPS+Min,D.3MA干预组:LPS+3MA+Min,E.3MA干预对照组:LPS+3MA。9.透射电镜下观察脓毒症小鼠心肌组织和原代脓毒性心肌细胞中线粒体自噬体和自噬体的数量,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测三磷酸腺苷(Adenosine Triphosadenine,ATP)、柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)活性、锰超氧化物歧化酶(Manganese SOD,Mn-SOD)活性水平评估线粒体功能。10.用Tunel染色评估脓毒症诱导的心肌或心肌细胞的凋亡水平。11.用ELISA法检测c Tn I、肌酸激酶MB(Creatine kinase MB,CK-MB)评估脓毒症诱导的小鼠心肌损伤。12.用ELISA法检测LDH评估心肌细胞损伤。13.Western blotting法检测心肌或心肌细胞中蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated Protein kinase B,p-Akt)、m TOR、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated m TOR,p-m TOR)、raptor、rictor、微管相关联蛋白轻链A/B(microtubule-associated protein light chain 3 A/B,LC3A/B)和自噬相关蛋白62(protein 62,p62)表达水平。14.用超声评估脓毒症小鼠心功能的影响。【研究结果】1.Min 50 mg/kg腹腔注射在CLP后3 d显著改善CLP诱导的脓毒症小鼠的生存率,及降低血清中c Tn I水平减轻心肌损伤,提高脓毒症小鼠左心室射血分数(ejection fraction,EF)和短轴缩短率(fractional shortening,FS)改善心功能,而且Min显著提高脓毒症小鼠的7-d生存率约40%。2.Min诱导心肌线粒体自噬显著增加心肌线粒体自噬体数目、心肌ATP数量、CS酶的活性和降低Mn-SOD的活性,改善脓毒症小鼠心肌损伤降低c Tn I和CK-MB水平,抗心肌细胞凋亡显著降低凋亡指数和caspase 3的表达水平。然而,给予自噬抑制剂3MA(60 mg/kg)后却逆转了Min诱导心肌线粒体自噬改善脓毒性心肌线粒体和心肌损伤的作用。3.LPS 5μg/ml显著诱导原代心肌细胞凋亡(凋亡指数约35%)和增加LDH释放水平,被确立为最佳的构建脓毒性细胞模型的LPS剂量。Min 80μg/ml诱导原代心肌细胞自噬显著增加自噬体数量,以及显著提高LPS诱导的原代心肌细胞中ATP含量和CS酶的活性。因此,Min通过诱导自噬改善LPS诱导的原代心肌细胞线粒体损伤,减少LDH释放,发挥抗LPS诱导的心肌细胞凋亡降低凋亡指数、减少caspase 3表达。然而,给予自噬抑制剂3MA(40μm)后却逆转了Min通过诱导自噬抗LPS诱导的心肌细胞凋亡。4.Min显著上调p-Akt、rictor、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、抑制p-m TOR、ripator、p62和caspase 3蛋白表达。给予自噬抑制剂3MA后逆转了Min调控这些蛋白分子的作用,揭示了Min靶向调控Akt/m TOR信号通路上调LPS诱导的原代心肌细胞自噬。5.Min显著增加CLP后3 d左心室的EF、FS和降低左心室收缩末容积(left ventricular end systolic volume,LVESV)改善脓毒症小鼠的心功能,提高CLP诱导的脓毒症小鼠7-d生存率。然而,给予自噬抑制剂3MA后却逆转了Min的这些作用,揭示了Min诱导自噬改善脓毒症心功能障碍,提高脓毒症存活率。【结论】本实验研究发现,在CLP诱导的脓毒症中,Min通过诱导心肌线粒体自噬发挥减轻线粒体损伤、抗心肌凋亡,改善脓毒症小鼠心功能和7-d生存率。在LPS诱导的原代心肌细胞脓毒症中,Min通过诱导心肌细胞自噬发挥减轻线粒体损伤、抑制心肌细胞凋亡。而且研究显示Min通过激活Akt抑制m TORC1和上调m TORC2再激活Akt抑制m TORC1上调LPS诱导的心肌细胞LC3II/LC3I水平和降低p62/GAPDH水平。这些结果揭示了,Min可能通过靶向调控Akt/m TOR机制诱导心肌或心肌线粒体自噬,改善脓毒症诱导的心功能障碍,为脓毒症的诊治提供新的思路。