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目的本研究应用放射性核素99mTc标记基因工程小分子抗体-EGFR Nanobody制备新型分子探针,以表皮生长因子受体(EGFR)为生物靶点,通过体内、外实验观察不同组织来源癌细胞及移植瘤组织对99mTc-EGFR Nanobody单体及3种多聚体(四、五和七聚体)的结合及SPECT显像特性,筛选理想的99mTc-EGFR Nanobody用于肿瘤放射免疫显像,同时分析其可能的机制,为这一类新型显像剂的临床应用提供实验基础。方法体外培养人不同组织来源癌细胞,包括人表皮癌A431细胞、人肺腺癌A549细胞、人大细胞肺癌NCI-H460细胞、卵巢癌SKOV3细胞、乳腺癌MDA-MB-453细胞、人前列腺癌DU-145及人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞。通过流式细胞术、免疫细胞化学、免疫荧光细胞化学方法检测上述细胞EGFR的表达；Western blot半定量分析不同癌细胞EGFR蛋白含量及差异。首先合成三羰基锝,然后与EGFR Nanobodies六聚组氨酸标签链接完成标记,标记混合物采用超滤离心法纯化,薄层层析法(TLC)测定放化纯,以硅胶板为固定载体,分别以0.9%氯化钠溶液和丙酮为流动相垂直上行展开。12孔板培养4种不同EGFR表达癌细胞(A431,A549,NCI-H460,OCM-1),每孔加入100μL含0.5%HEPES和0.5%BSA的混合液用于封闭非特性结合。分组设99mTc-EGFR Nanobody单体、99mTc-EGFR Nanobody四聚体、99mTc-EGFR Nanobody五聚体和99mTc-EGFR Nanobody七聚体组;组内设竞争阻断组,即每孔细胞预先加入2μg相应未标记的EGFR Nanobody(10μL),37℃孵育1h后再加入相应标记抗体；每孔细胞内均加入1μCi(37KBq)99mTc-EGFR Nanobody (1μg,10μL),37℃孵育1h；以99mTcO4-为阴性对照组,以上各组均设4个平行管。分离并收集每孔细胞及上清液,γ计数器测定其放射性计数(CPM),计算癌细胞对标记抗体的结合率。BLAB/C-nu小鼠左上肢近腋窝皮下种植A431、A549、SKOV3和OCM-l癌细胞(0.5-1×107细胞/150μL)制备移植瘤小鼠模型,待肿瘤直径长至约1.0cm时用于实验。移植瘤小鼠尾静脉注射100μL99mTc-EGFR Nanobodies(7.4-18.5MBq),于30、60、90、120及180min分别行SPECT全身显像,配针孔准直器采集图像,观察移植瘤小鼠的放射性分布,通过勾画感兴趣区(ROI)计算移植瘤T/NT比值,分析4种标记抗体在不同癌细胞移植瘤小鼠体内的分布及肿瘤组织显像特点。显像结束后处死动物,切取肿瘤组织,应用组织免疫化学法(IHC)检测移植瘤组织EGFR表达水平。统计数据以均数士标准差表示,SPSS统计分析,组间比较用单因素方差分析,P<0.05,差异有统计学意义。结果7种癌细胞体外培养生长良好,增殖迅速,形态各异,EGFR表达水平存在差异,其中A431,A549,NCI-H460,SKOV3细胞为EGFR阳性表达,MDA-MB-453和DU145细胞为弱阳性表达,OCM-1细胞为阴性表达。99mTc标记EGFR Nanobodies超滤离心后放化纯均大于95%,体外6h内稳定。A431,A549,NCI-H460细胞对4种99mTc-EGFR Nanobody均有不同程度的结合率,明显高于对照组99mTcO4-;各组细胞未标记抗体竞争阻断后,结合率均出现下降,部分差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR阴性表达OCM-1细胞对4种99mTc-EGFR Nanobody也有不同程度的结合率。EGFR表达阳性的A431移植瘤小鼠静脉注射99mTc-EGFR Nanobody五聚体90min后,肿瘤组织显示较清晰,最高T/NT=2.9。99mTc-EGFR Nanobody单体、四聚体和七聚体在4种移植瘤组织均未见明显浓聚,其中99mTc-EGFR Nanobody单体主要浓聚于肾脏和膀胱,99mTc-EGFR Nanobody四聚体和七聚体肝脏明显浓聚,肾脏和膀胱有部分浓聚。结论不同的癌细胞具有EGFR表达差异。三羰基锝标记EGFR Nanobodies方法简便可行。4种不同99mTc-EGFR Nanobody在不同癌细胞的体外结合与体内移植瘤SPECT显像存在不一致。EGFR表达阳性的癌细胞与4种99mTc-EGFR Nanobodies均有一定的结合率,可被未标记相应抗体部分阻断。体内移植瘤模型SPECT显像,99mTc-EGFRNanobody五聚体在EGFR阳性表达A431细胞移植瘤组织有较高分布,具有进一步研究的价值。99mTc-EGFR Nanobody单体可能由于分子量过小,在体内经肾脏快速排泄;99mTc-EGFR Nanobody四聚体和七聚体肝脏蓄积明显,肿瘤组织无明显浓聚,均不是理想的放射免疫显像剂。