论文部分内容阅读
目的 丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 3型(Serine peptidase inhibitor,Kazal type 3,SPINK3)不仅是一种胰蛋白酶抑制剂,而且还是一种与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)结构相似的生长因子,能够与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)结合从而激活其下游信号通路促进细胞增殖。本实验室之前通过对SPINK3基因添加和干扰检测了其对大鼠正常肝细胞的调控作用,但对其调控机制尚不够确切。为此,本文将进一步研究SPINK3过表达以及干涉对原代大鼠肝细胞增殖的调控作用,以及大鼠重组SPINK3蛋白(rat recombinant SPINK3,rrSPINK3)对大鼠正常肝细胞株BRL-3A和肝癌细胞株RH-35的增殖调控作用。方法 在基因水平研究中,首先构建了SPINK3的表达载体pHBAd-MCMV-RFPSPINK3,通过腺病毒包装侵染原位灌流法分离获得的原代大鼠肝细胞,使SPINK3在原代大鼠肝细胞中内源性过表达;设计SPINK3 siRNA片段,通过脂质体转染原代大鼠肝细胞,降低细胞中SPINK3的表达水平。在蛋白水平的研究中,用rrSPINK3分别处理大鼠正常肝细胞BRL-3A和肝癌细胞RH-35,外源性地增加两种细胞中SPINK3的含量。通过MTT方法各组检测细胞活力情况,BrdU法检测各组细胞增殖情况以及流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡情况,并且通过qRT-PCR和Western blot检测SPINK3信号通路中相关基因和蛋白的表达情况,分析SPINK3表达变化对原代大鼠肝细胞、BRL-3A细胞以及RH-35细胞的作用机制。结果 SPINK3过表达和干涉对原代大鼠肝细胞的作用研究结果显示,SPINK3过表达能够促进原代大鼠肝细胞的增殖,抑制细胞凋亡;而干涉SPINK3后抑制了原代大鼠肝细胞的增殖,促进了细胞凋亡。此外,qRT-PCR和Western blot结果显示SPINK3可能通过PI3K/AKT、JAK/STAT和SRC/P38信号通路促进原代大鼠肝细胞增殖。rrSPINK3对BRL-3A细胞和RH-35细胞的研究结果显示,rrSPINK3可以促进两者的细胞增殖,且能够显著地抑制RH-35细胞的凋亡,但对BRL-3A细胞的凋亡没有明显作用。qRT-PCR和Western blot结果显示,rrSPINK3可能通过PI3K/AKT和SRC/P38两条信号通路调节BRL-3A细胞增殖,而对RH-35细胞来说,rrSPINK3可能通过JAK/STAT、HRAS/JNK1和SRC/P38三条信号通路来调节RH-35细胞增殖。结论 综上所述,SPINK3均可以促进原代大鼠肝细胞、BRL-3A细胞和RH-3A细胞的增殖。