许多物种的滞绿突变体具有相似的表型特征,即衰老被延缓,叶绿素不降解或降解缓慢。但由于遗传背景不同,它们滞绿的分子机理相差很大。本课题的研究是以滞绿突变体的生理生化(叶绿素的酶代谢途径)、遗传特征及分子生物学特性为基础,重点对控制滞绿表型的一个基因SGR进行研究。SGR是一个细胞核基因,受衰老诱导而特异表达的基因,属于SAGs基因。它的功能的缺失导致高等绿色植物出现滞绿的表型,近年来对它的研究还处于初始阶段。我们以番茄AC++和gf滞绿突变体为材料对番茄中SGR的同源基因LeSGR1基因进行了研究。主要研究结果如下:(1)在番茄中克隆出SGR的同源基因并命名为LeSGR1基因,其cDNA长1.2kb,它包含一个816bp的开放阅读框,部分5’UTR约145bp,3’UTR有259bp,816bp的编码区编码272个氨基酸残基,分子量为30kD,等电点为8.74 (NCBI GenBank登录号:DQ100158)。与双子叶植物拟南芥和大豆同源性分别为78%、75%,与亲缘关系较远的单子叶植物也有66%的同源性。(2)对LeSGR1基因核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列进行生物信息学预测发现,编码的蛋白有4个最有可能被磷酸化的位点,即202、205、217位点的丝氨酸和位于82位点的苏氨酸以及3个可能O-糖基化位点分别为位于6、216及219的氨基酸残基。LeSGR1基因编码的蛋白没有跨膜结构,二级结构预测显示这个蛋白有9个较明显的β折叠和7个α螺旋,它最后发挥活性的细胞亚结构部位可能在叶绿体中。(3) LeSGR1基因的DNA序列约有2.1kb,4个外显子分别被长为100bp、1118bp、167bp的3个内含子隔开。其外显子和内含子接头符合受体拼接点和供体拼接点的Chambon法则。LeSGR1基因5’UTR上游侧翼区启动子部分长0.9kb。经过生物信息学软件分析,它包含了多个TATA-box,GC-box,CAAT-box,以及其他顺式作用元件如乙烯作用元件(ERE)、热激(干旱)HSE元件、MBS元件、防卫和压力发应元件以及水杨酸作用元件(TCA-element)。(4) LeSGR1基因的表达模式研究,发现在幼嫩叶和成熟叶中LeSGR1基因的mRNA水平极低,基本检测不到表达信号,而在衰老叶片中则大量表达,mRNA的水平显著增强,表明LeSGR1基因受衰老诱导而特异表达,属于SSG基因。在番茄的果实中,特别是成熟期B及B期以后的时期持续大量表达。在乙烯突变体的番茄中LeSGR1基因的表达相对于AC++番茄有所降低,表明乙烯对SGR基因的表达有正向调控作用。在失水和黑暗逆境条件下番茄LeSGR1基因的表达增高。(5)根据siRNA序列设计要求,构建了LeSGR1基因的RNAi载体,并转化到了AC++番茄中,得到了8棵转化苗。这为进一步了解研究LeSGR1基因的功能打下了基础。(6) AC++和gf突变体在成熟叶片和MG时期的果实里叶绿素含量并没有显著的差异。但是在衰老的叶片和成熟的果实里, gf中叶绿素的含量要明显的高于AC++。gf突变体的衰老叶片显示出一种完全保持绿色的表型,而成熟的果实由于未降解的叶绿素而为铁锈色。(7)克隆了gf突变体中的SGR基因,序列比对分析发现,gf的SGR基因核苷酸在高度保守区里发生了一个碱基的变异,由碱基A变成了T,直接导致了一个氨基酸的改变,即由Arg变成了Ser。在完成对35S∷LeSGR1超表达载体的构建后,并成功地转化到gf突变体中,这为以后探索这个碱基的变异是否导致gf的滞绿表型以及揭示gf的滞绿机制打下了基础。