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目的:检测JAK2 V617F阳性骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者中程序性死亡受体-1(PD-1)、程序性死亡配体-1(PD-L1)及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的表达及意义,探讨干扰素-α2b(IFN-α2b)和芦可替尼(Ruxolitinib)对PD-1、PD-L1及Treg细胞表达的影响及作用机制。方法:1选取2016年09月至2018年12月期间保定市第一医院住院或门诊MPN患者及部分健康志愿者作为研究对象,经荧光定量PCR检测后,所有MPN患者初诊时JAK2 V617F均阳性。其中初治组41例(23例男性,18例女性,年龄27~82,中位年龄60岁。其中11例真性红细胞增多症(PV);12例原发性骨髓纤维化(PMF);18例原发性血小板增多症(ET)),IFN-α2b治疗组20例(11例男性,9例女性,年龄27~81,中位年龄62岁。其中6例真性红细胞增多症(PV);6例原发性骨髓纤维化(PMF);8例原发性血小板增多症(ET));另选择20例健康志愿者作为对照组(10例男性,10例女性,年龄25~66,中位年龄59岁)。另有5例病情进展或转白血病患者(3例男性,2例女性,年龄68-81,平均年龄74岁)。全部入组患者均签署知情同意书并经由保定市第一医院伦理委员会批准。2实验分组:将JAK2V617F阳性的MPN患者分为初治组(初诊未经治疗组)41例;治疗组(本组患者均接受皮下或肌肉注射IFN-α2b,治疗至少6个月以上,3次/周,每次3×10~6U)20例;对照组(健康志愿者)20例。3使用荧光定量PCR检测MPN患者的JAK2 V617F/JAK2突变率(突变型JAK2/野生型JAK2比值)。4采用流式细胞术检测初治组、治疗组及对照组PD-1、PD-L1、Treg的表达情况。5体外培养:选取15例初治组患者骨髓及外周血标本进行体外细胞培养,检测1×10~6U/L IFN-α2b作用48h前后PD-1、PD-L1及Treg表达情况;选取12例初治组患者骨髓及外周血标本进行体外细胞培养,检测250nmol/L Ruxolitinib作用48h前后PD-1、PD-L1及Treg表达情况。6采用SPSS19.0软件分析所有数据,所有符合正态分布的数据均采用方差分析进行多组间比较,组间两两比较选用q检验,两变量之间的相关程度采用Pearson直线相关分析法分析,IFN-α2b及Ruxolitinib体外干预数据符合非正态分布,所有非正态分布数据均采用Wilcoxon秩和检验分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1骨髓增殖性肿瘤患者的JAK2V617F突变量PCR结果显示:所有MPN患者在初次诊断时用荧光定量PCR检测JAK2 V617F突变均阳性。初治组41例,JAK2 V617F突变量为54.12%±24.86%;IFN-α2b治疗组20例,JAK2 V617F突变量为40.12%±20.55%;前者明显高于后者,并且差异具有统计学意义(P<0.05)。2流式细胞术检测PD-1、PD-L1及Treg在骨髓增殖性肿瘤患者中的表达水平PD-1主要表达在活化的T、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞表面,部分肿瘤细胞亦表达PD-1,PD-L1主要表达在肿瘤细胞及抗原递呈细胞(APC)表面。初治组PD-1、PD-L1在骨髓髓系细胞表达的阳性率为(40.87%±23.11%;44.79%±19.15%)高于治疗组(17.86%±10.59%;29.95%±14.83%)及对照组(1.62%±0.78%;1.63%±0.84%),差异均有统计学意义(P<0.01);Treg在初治组中表达的阳性率为(12.24%±7.41%)高于治疗组(5.26%±3.64%)及对照组(1.24%±0.83%),差异有统计学意义(P<0.01);淋巴细胞PD-1、PD-L1在初治组和IFN-α2b治疗组中表达水平比对照组高,但总体表达水平仍较低,差异无统计学意义(均P>0.05)。3初治组JAK2 V617F阳性骨髓增殖性肿瘤患者中JAK2 V617F、PD-1、PD-L1及Treg表达的相关性Pearson相关性分析显示:髓系细胞PD-L1与髓系细胞PD-1呈正相关(r=0.758,P<0.01);淋巴细胞PD-1与髓系细胞PD-1呈正相关(r=0.382,P<0.05);髓系细胞PD-1与JAK2 V617F突变量呈正相关(r=0.498,P<0.01);髓系细胞PD-L1与JAK2 V617F突变量呈正相关(r=0.686,P<0.01);淋巴细胞PD-1与JAK2 V617F突变量呈正相关(r=0.406,P<0.01)。上述各组与Treg表达经分析后均无相关性(P>0.05)。淋巴细胞PD-L1表达与各组间亦无相关性(P>0.05)。初治组患者共41例,以JAK2 V617F突变量50%为界分为JAK2V617F突变量≥50%组和JAK2 V617F突变量<50%组,分别有21例、20例。结果:JAK2≥50%组与JAK2<50%组髓系细胞PD-1的表达分别为(42.86%±19.61%;26.25%±22.28%);淋巴细胞PD-1的表达分别为(4.20%±4.62%;1.99%±2.01%);髓系细胞PD-L1的表达分别为(51.43%±17.12%;31.38%±15.79);Treg的表达分别为(11.61%±8.70%;8.72%±5.65%)。JAK2≥50%组髓系细胞PD-1、PD-L1,淋巴细胞PD-1及Treg表达均明显高于JAK2<50%组,差异有统计学意义(P<0.05)。另有5例病情进展或转白血病患者,其中3例男性,2例女性,年龄68-81岁,平均年龄74岁。JAK2V617F突变量、髓系细胞PD-1、髓系细胞PD-L1、淋巴细胞PD-1及Treg的表达量分别为(84.72%±5.70%;76.50%±5.36%;12.74%±4.44%;27.25%±7.92%)。该组患者JAK2V617F突变量、髓系细胞PD-1、髓系细胞PD-L1、淋巴细胞PD-1及Treg表达明显高于初治组、治疗组和对照组,因病例较少,故未进行统计学分析。4 IFN-α2b及Ruxolitinib对体外培养骨髓增殖性肿瘤患者原代细胞PD-1、PD-L1及Treg表达的影响取1×10~6U/L IFN-α2b体外干预原代细胞后,髓系细胞PD-1、PD-L1及Treg的表达减低,干预前组髓系细胞PD-1、PD-L1及外周血Treg的表达量分别为(48.48%±19.70%;42.54%±22.14%;10.0%±19.40%)高于干预后组(45.55%±19.59%;35.79%±19.12%;5.27%±6.54%),差异有统计学意义(P<0.05);淋巴细胞PD-1分别为干预前(4.21%±4.32%);干预后(1.67%±1.28%),表达无明显变化且差异无统计学意义(P>0.05)。取250nmol/L Ruxolitinib体外干预原代细胞后,髓系细胞PD-1、PD-L1及Treg的表达减低,干预前组髓系细胞PD-1、PD-L1及外周血Treg的表达量分别为(42.88%±24.92%;46.73%±21.76%;10.14%±10.92%)高于干预后组(25.54%±19.70%;34.68%±23.51%;5.16%±7.52%),差异有统计学意义(P<0.05),淋巴细胞PD-1分别为干预前(2.65%±2.82%);干预后(1.40%±1.47%),表达无明显变化且差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1 PD-1、PD-L1及Treg共同参与了骨髓增殖性肿瘤患者的发病。2在骨髓增殖性肿瘤患者中,肿瘤细胞(即髓系细胞)高表达PD-1及PD-L1,同时外周血Treg细胞表达增高。3 JAK2 V617F基因突变量与髓系细胞PD-1和PD-L1的表达量呈正相关。高表达PD-1和或PD-L1可能与预后不良及白血病转化有关。4 IFN-α2b治疗后MPN患者的JAK2 V617F突变量减低,同时PD-1、PD-L1及Treg细胞表达也减低。5 Ruxolitinib在体外可以使MPN患者骨髓原代细胞PD-1、PD-L1及外周血Treg细胞表达减低。