通过控制基因在特定时间和特定空间上的精准表达,生物体能够顺利完成发育、增殖、凋亡、衰老和分化等生物学过程,而基因的表达失常往往会导致疾病的发生。在生物体中,基因表达的调控包括对转录、RNA加工、运输、翻译等过程的控制以及对产物稳定性的控制。因此,控制这些生化过程就能够操控和干扰基因的表达,这不仅有助于了解基因网络的复杂功能,研究疾病的发生机制,还能够为基因表达异常所引起的相关疾病寻找治疗方案。CRISPR系统的发现及其在哺乳动物细胞中的应用为控制基因的表达提供了有力的工具。本论文中我们重点研究CRISPR技术作为转录调控和转录后调控工具时的新体系构建与应用。通过将转录调控因子与失活的dCas9融合,能够实现靶标基因的转录激活或抑制。通过引入多种光响应或小分子响应模块,已经开发出了多种dCas9系统用于可控地转录激活或抑制。然而,目前仍旧需要开发新的可编程模块,用以提高转录调控效率,以实现更加稳健和灵活的dCas9转录控制。因此,在第二章中我们在已知效率较高的dCas9-VPR体系中引入两个RNA适配体结合蛋白,得到dCas9融合蛋白和VPR融合蛋白,通过RNA适配体和对应蛋白之间的相互作用将转录调控因子招募到dCas9上,从而实现结构RNA介导的转录调控。利用该体系,我们进一步提高了报告基因和内源基因的转录激活效率;且通过简单改变结构RNA上适配体的数目就能够实现对所招募转录因子数目的控制,从而改变转录调控的效率,避免了利用改造的sgRNA招募转录调控因子可能导致的sgRNA结构失效等问题。此外,在第三章中,基于构建的新体系,我们引入一个竞争蛋白,与dCas9融合蛋白竞争性地结合结构RNA,从而破坏转录激活复合物的形成,抑制转录激活,然后通过在竞争蛋白的3’UTR区加入microRNA结合位点,实现microRNA控制的dCas9转录调控。该体系的建立为高效、可控的转录调控提供了一个灵活的、可设计的平台。除了转录调控,CRISPR-dCas9作为一个简单的DNA结合蛋白已经被广泛用于碱基编辑、基因组修饰、染色体成像等多个重要领域。为了有效地控制dCas9体系的作用,研究人员利用自然界中存在的CRISPR抑制剂——anti-CRISPR,实现了对Cas9系统的高效抑制。然而,小分子化合物相比蛋白有更快的动力学,且具有细胞渗透性、可逆性和抗蛋白水解的稳定性,能够更加精准快速地控制dCas9体系。因此,在第四章中,我们构建了 一个新的体系,即在已有的dCas9-VPR转录激活系统中引入一个相互作用蛋白对,且该相互作用能够被一个特定的小分子化合物破坏。因此,在没有小分子化合物存在时,通过蛋白-蛋白相互作用招募转录激活因子,转录激活发生;而加入了小分子之后,蛋白-蛋白相互作用被破坏,转录激活停止。基于该设计,我们实现了小分子控制的转录激活,激活效率随着小分子浓度的增加呈降低趋势。该工作为设计小分子抑制的dCas9体系提供了一个简单可靠的策略,有望拓展到Cas9体系中,实现小分子抑制的基因编辑。此外,对RNA的控制也是实现基因表达调控的一个重要途径,CRISPR-Cas13的发现为这一目的提供了有效的工具。相比于RNA干扰技术,Cas13具有更高的敲除效率和更低的脱靶率,因此被用于细胞内RNA的剪切。常用的Cas13系统递送方法中,RNA递送无需进入细胞核,降低了插入突变的风险,且RNA在细胞内活性持续时间较短,降低了脱靶可能性。为了进一步了解Cas13 mRNA在体内作用的效果和规律,更好地应用到癌症检测和治疗中,在第五章中,我们通过体外转录得到了 Cas13 mRNA以及crRNA,通过改变crRNA间隔序列长度以及正向重复序列结构,研究了在以RNA形式递送的Cas13系统中,crRNA改变对于RNA靶标剪切效果的影响。该工作为未来Cas13在实际应用当中以RNA形式递送时,crRNA的设计和选择提供了参考。