【摘 要】
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猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE）是一种急性、高度接触性肠道传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失,其病原是猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）,TGEV感染猪小肠上皮细胞（Intestinal Porcine Epithelial Cell,IPEC-J2）引起细胞严重的形态变化与生
【基金项目】
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国家自然科学基金（NO.31472167）； 中国博士后基金（NO.2015M570860）； 中央重大农业技术推广资金项目（NO. K3360217060）；
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猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE）是一种急性、高度接触性肠道传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失,其病原是猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）,TGEV感染猪小肠上皮细胞（Intestinal Porcine Epithelial Cell,IPEC-J2）引起细胞严重的形态变化与生化功能障碍,诱导线粒体损伤。microRNA在病毒诱导细胞线粒体损伤过程中发挥了重要的作用,前期研究发现,TGEV感染IPEC-J2后miR-885发生了显著变化,但是,miR-885是否参与调控TGEV诱导的IPEC-J2线粒体损伤调控线粒体损伤,至今尚不清楚。本研究首先用TGEV感染IPEC-J2,检测TGEV感染后细胞miR-885表达的变化,然后筛选鉴定miR-885的靶基因,进一步研究miR-885及其靶基因对TGEV诱导的IPEC-J2线粒体损伤的调控作用及机制。研究取得如下结果。1.以1.0 MOI TGEV感染IPEC-J2,接毒后24 h,检测细胞线粒体钙离子浓度变化,结果显示,与对照相比,感染细胞线粒体钙离子浓度显著升高（p＜0.01）。Real-time PCR检测TGEV感染IPEC-J2后miR-885表达,结果显示,TGEV感染24 h后,miR-885表达量显著升高（p＜0.01）。2.将miR-885 mimics和miR-885 inhibitors分别转染至IPEC-J2 24 h后,再用1.0 MOI TGEV感染IPEC-J2。感染后24 h,检测线粒体钙离子浓度变化情况,结果显示,过表达miR-885后,线粒体钙离子浓度显著升高（p＜0.01）,抑制miR-885后,线粒体钙离子浓度显著降低（p＜0.05）。3.生物信息学分析得到miR-885的靶基因是bcl-10。构建含bcl-10 3′UTR的重组双荧光素酶质粒,检测miR-885与bcl-10 3′UTR的结合活性,结果显示,过表达miR-885后,含bcl-10 3′UTR重组质粒的细胞双荧光素酶活性显著降低（p＜0.01）,同时构建psi CHECK-2-BCL-10-MUT突变载体,进行双荧光素检测,确定miR-885与靶基因bcl-10的结合位点。将miR-885 mimics和miR-885 inhibitors分别转染IPEC-J2,western blotting检测显示,过表达miR-885后BCL-10蛋白水平显著降低。抑制miR-885后,BCL-10蛋白水平显著升高。4.设计合成bcl-10的siRNA干扰bcl-10的表达,同时构建重组bcl-10真核表达质粒p EGFP-N1-BCL-10过表达bcl-10,si BCL-10或重组p EGFP-N1-BCL-10质粒转染至IPEC-J2,24 h后,以1.0 MOI TGEV感染IPEC-J2。感染后24 h,检测线粒体钙离子浓度变化,结果显示,过表达bcl-10能够使线粒体钙离子浓度显著下降（p＜0.01）;相反,抑制bcl-10表达则使线粒体钙离子浓度显著上升（p＜0.01）。本研究发现miR-885能够促进线粒体损伤;双荧光素酶试验和western blotting试验结果证明bcl-10是miR-885的靶基因;miR-885通过抑制靶基因bcl-10促进TGEV诱导IPEC-J2线粒体损伤。研究结果阐明了miR-885在TGEV诱导IPEC-J2线粒体损伤过程中的作用与调控机制,为进一步研究宿主细胞miRNA与TGEV的相互作用提供理论依据。
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