【摘 要】
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随着全球气候变暖,在过去的30年中,世界葡萄酒酒度平均升高了2%v/v。较高的酒度给葡萄酒带来各种不良感官影响,因此,利用合理技术手段,降低葡萄酒酿造过程中乙醇生成量,成为葡萄酒工业亟待解决的问题,而利用乙醇合成能力弱化的酿酒酵母菌株进行发酵,是最简单和最经济的解决方法。本研究利用转录因子Spt15p随机突变的酿酒酵母YS59文库,筛选乙醇合成能力弱化的酿酒酵母菌株,同时利用转录组与代谢组学手段,
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随着全球气候变暖,在过去的30年中,世界葡萄酒酒度平均升高了2%v/v。较高的酒度给葡萄酒带来各种不良感官影响,因此,利用合理技术手段,降低葡萄酒酿造过程中乙醇生成量,成为葡萄酒工业亟待解决的问题,而利用乙醇合成能力弱化的酿酒酵母菌株进行发酵,是最简单和最经济的解决方法。本研究利用转录因子Spt15p随机突变的酿酒酵母YS59文库,筛选乙醇合成能力弱化的酿酒酵母菌株,同时利用转录组与代谢组学手段,以期从整体水平阐释酿酒酵母乙醇合成能力弱化的机制。主要研究结果如下:（1）获得一株乙醇产率降低34.89%的酿酒酵母菌株,其Spt15p上5个氨基酸发生突变。以乙醇产率为指标,对Spt15p突变文库菌株进行模拟葡萄汁发酵复筛,获得一株乙醇产率降低34.89%的酿酒酵母菌株YS59-409（乙醇产率0.239 g/g糖）,且YS59-409的生物量与CO2失重都相比对照增加。推测该菌株可能将更多的糖用于菌体合成和CO2生产,减少了用于乙醇合成的碳流,从而导致YS59-409菌株乙醇产率降低。对YS59-409转录因子Spt15p进行突变分析,发现有5个氨基酸同时发生突变,分别为Ile 46Met、Asp 56 Gly、Ser 118 Pro、Tyr 195 His和Leu 205 Ser。但是,对上述氨基酸进行单点突变,结果却显示,乙醇产率分别增加了8.07%、10.99%、1.05%、3.12%和10.37%。（2）对YS59-409进行了转录组学分析,挖掘出9个疑似关键基因。以YS59-p Y16菌株为对照,采用RNA-Seq技术,对发酵中期的低产乙醇菌株YS59-409进行转录组学分析,筛选与乙醇合成相关的差异表达基因,并进行网络互作分析,挖掘关键基因。结果显示,转录组分析筛选到显著差异表达基因203个（101个基因下调,103个基因上调）。通过GO与KEGG pathway分析发现,YS59-409低产乙醇的特性,可能与碳源分流至其他代谢终端（甘油）、酵母对己糖的吸收效率下降以及酵母对乙醇的胁迫响应有关。结合差异基因互作网络分析,最终挖掘到的9个疑似关键基因,分别是RPL22B、REX4、IMA1、YNL195C、SOR2、YNL194C、HXT2、RGI2和AQY3。（3）基于LC-MS对YS59-409进行了代谢组学分析。以YS59-p Y16菌株为对照,采用LC-MS代谢组学技术对低产乙醇菌株YS59-409进行代谢组学分析,寻找差异代谢产物并进行通路分析。结果显示,42种代谢物具有差异,对其进行代谢通路分析发现,显著差异代谢路径中最主要的差异代谢物有L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、腺苷酸琥珀酸、丙酮酸、琥珀酸半醛和谷胱甘肽等。分析表明谷氨酸与谷氨酰胺代谢与甘油途径相关,可能通过增加甘油来平衡谷氨酸与谷氨酰胺代谢途径中过多的NADH,从而减少乙醇合成的碳源。参与NAD+从头合成的犬尿氨酸途径相关代谢物有所上调,可能是胞内NAD+含量不足（NADH过量）的响应,这与通过甘油来平衡过多的NADH的推论相一致。这可能是酵母低产乙醇的主要原因。（4）RGI1/2基因显著影响酿酒酵母乙醇合成能力。利用一步克隆法构建RGI1/RGI2过表达菌株（BY4741 p Y26/RGI1、BY4741 p Y26/RGI2）,利用Cre-Loxp系统构建RGI1/RGI2敲除菌株（BY4741 p Y26/△RGI1、BY4741 p Y26/△RGI2）,并将上述工程菌株进行模拟葡萄汁发酵。结果显示,相对于对照菌株,RGI1/2基因过表达和敲除菌株发酵速率均略有降低,同时乙醇产率均显著降低,分别降低了20.43%、19.34%、21.36%和15.47%。研究结果说明RGI1/2在酿酒酵母的乙醇代谢中具有重要作用。
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