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研究背景和目的糖尿病微血管病变包括肾脏病变、神经病变、视网膜病变。并发症发展的风险因素受许多因素影响,包括糖尿病持续时间和基因因素。[1]糖尿病(DM)最常见的微血管并发症之一糖尿病肾病(DN),是导致西方国家终末期肾病(ESRD)和DM患者死亡的重要原因,也是成为终末期肾病(ESRD)的首要原因。在我国,DN在导致ESRD的数量也逐年增加。[2]当前DN的致病机制尚不完全清楚,有效的治疗手段尚不足,因此,有效地早期干预和预防、治疗DN已是医学领域中重要的问题,尤其是随着人口老龄化,糖尿病基础人群数量的增加,糖尿病肾病的发病率也将增加,这将极为重要。不管是1型糖尿病还是2型糖尿病均可导致血管并发症,除了高血糖、高低密度脂蛋白、晚期糖代谢产物、生长因子及炎症因子外,需要更好的理解糖尿病的分子机制来确定新的治疗目标。[3]理解糖尿病并发症潜在的发病机制,为这种慢性病状态发展新的和改进的治疗策略仍然非常重要。新的方法来自线虫研究确定了一种新的内源性、小片段、单链、非编码RNA分子,被命名为微小RNA,这种微小RNA作为生长的调控因子。[4] MicroRNA (miRNAs)是微小RNA,普遍存在真核生物中。由前体(pre-miRNA)进一步成熟为miRNA,具体为内源性发夹状结构长度为70~80nt的miRNA具体(pre-miRNA)剪切后生成,成熟miRNA是一类长约21~24nt的通过转录后负调控靶基因表达的非蛋白编码RNA分子,可结合靶基因mRNA3’端非翻译区(3’-untranslatedregion,3’-UTR)互补结合而调控靶mRNA表达。[4]体液循环microRNA是存在于细胞外的microRNA特殊存在方式。研究发现在人体的血清、血浆、尿液、唾液、乳汁等体液中都能检测到多种microRNAs。体液中的microRNA分子多数不是以游离形式存在的,它被脂质、蛋白复合体、微囊泡(microvesicle, MV)、外夹体(exosome)等包裹和结合,因此具有良好的抗RNase降解能力,有较高的稳定性。[5]在来源细胞受到生物学因素刺激后,可以选择性地把特定的microRNA包裹进MV,同时细胞表面标记也携带在MV表面。用不同组织、细胞的表面标记抗体磁珠可以容易的检测到不同组织来源的MV及microRNA。正是由于血清循环microRNA的特点,它非常适合作为生物标记物用于疾病的预警和早期诊断。因其变化早于靶基因的变化、具有体液中的稳定性、细胞间的穿梭性以及组织来源特异性的特点,它非常适合作为生物标志物用于疾病的预警和早期诊断。[24]上世纪50年代自从messager RNA的发现,蛋白质和mRNA这个生物聚合物之间的关系已经被主要研究在遗传信息的传递和蛋白质的合成。而近年研究热点在mRNA的调控,尤其是miRNA在mRNA调控中的作用。MiRNA是短的RNA序列,源自发夹结构前体Pre-miRNA,其在转录后调控中发挥关键的作用,通过形成双重作用,与靶mRNA完全互补则清除靶基因,不完全互补则抑制靶基因。[15]microRNA作为一种潜在的载体,在蛋白质表达稳定传递和动态竞争的内源性RNA网络中。miRNAs能诱导蛋白质合成的阈值,这种蛋白产量的阈值能被聚集反应的转录因子完成。所以miRNA虽然小但发挥调控蛋白合成的作用。[16]DNA编码mRNA再翻译成蛋白质,miRNA对靶基因mRNA起到抑制或清除的作用,所以miRNAs与蛋白质可能呈负相关。可以怀疑某种蛋白的增加可能与抑制它的miRNAs减少有关,因此在与正常对照中检测降低的miRNA可能更有意义。通过miRCURYTMLNAexpression array芯片技术筛选糖尿病肾病组、糖尿病组、健康组差异miRNAs谱,并结合TargetScan、MirBase等数据库寻找可能与糖尿病肾病发病相关的miRNAs,并进一步经RT-PCR验证,对揭示糖尿病患者发生糖尿病肾病的microRNA机制,为后续研究及探讨miRNAs在DN发病中的作用奠定基础,并有望确定出1-2个可作为预警标记物的血清miRNA。研究对象和方法通过选取年龄、性别匹配的糖尿病肾病患者、单纯糖尿病患者、健康对照组各20人经上海康成生物公司完成miRCURYTM LNA expression array芯片筛选三组中microRNAs的差异,进一步结合miRBase、TargetScan Human、miRtarBase等数据库分析可能与糖尿病肾病发病相关的miRNAs15个,进一步通过RT-PCR验证,并使用2-ΔΔcT法分析组间倍数关系。结果1、miRCURYTM LNA expression array芯片结果：根据microRAN array信号强度2倍以上三组之间的差异有：糖尿病肾病组比健康组上调的microRNAs158个,下调的microRNAs150个;糖尿病肾病组比糖尿病组上调的microRNAs14个,下调的microRNAs6个；糖尿病组比健康组上调106个,下调125个。2、应用生物信息学在miRBase、miRtarBase、TargetScan数据库中获得可能与糖尿病肾病发病机制相关的microRNAs15个,hsa-miR-150-5p、 hsa-miR-485-3p、hsa-miR-205-3p、hsa-miR-302e、hsa-miR-495-5p、 hsa-miR-361-3p、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-484、hsa-let-7a-2-3p、 hsa-miR-532-3p、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-519e-3p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-216a-3p、hsa-miR-328-3p。3. RT-PCR验证：分别设计15个microRNAs的引物,根据QIAGEN公司的miRNAs内参miR-39为内参照,经RT-PCR验证,糖尿病肾病组miR-150比健康组明显减少,P<0.05,而糖尿病组和健康组无意义。结论：糖尿病肾病患者循环miR-150较健康对照组减少,与miRCURYTM LNA expression array芯片结果一致,miRNA-150可能作为糖尿病肾病的早期预警标记物。