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一、共刺激分子B7-H3在原发性肝癌中的表达及临床意义目的：检测B7家族新成员B7-H3(B7homelogue3)在原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma, PHC)组织和血清中的表达情况,探讨其在PHC发病及进展中的作用。方法：收集2008年1月至2008年11月在烟台毓璜顶医院住院的肝癌患者癌组织和血清标本63例,男49例,女14例,均经病理证实为原发性肝癌；5例肝血管瘤的瘤旁组织作为正常肝组织对照；同期收取50例健康体检人员外周血标本为正常对照。采用免疫组化检测正常肝组织和肝癌组织中B7-H3的表达,ELISA检测肝癌患者和正常人血清中可溶性B7-H3(sB7-H3)的含量。具体如下：(1)采用免疫组织化学染色方法检测63例肝癌患者肝癌组织中B7-H3的表达情况；根据B7-H3的着色深浅和着色面积综合判定,把表达结果分为阳性和阴性。(2)收集患者年龄、性别、组织学类型,淋巴结转移,远处转移等临床病理指标,并将各项指标与肝癌组织中的B7-H3表达结果进行统计学分析。(3) ELISA法检测血清中可溶性B7-H3的含量,对B7-H3的表达水平与肿瘤大小、病理分期、组织学类型,淋巴结转移,远处转移等临床病理要素进行统计分析,同时探讨其与临床常用诊断指标AFP, CA19-9, CEA之间的相关性。结果：(1)B7-H3在肝癌组织中弥漫性表达,63例肝癌组织中,57例样本表达阳性,其阳性表达率为90.5%；但在正常肝组织表达较低或不表达；(2)统计分析结果显示,B7-H3在癌组织中的表达水平与患者各临床病理因素无明显相关性。(3) ELISA检测结果显示,肝癌患者外周血sB7-H3含量为(4143.47±976.27) pg/ml,显著高于正常对照组(2076.18±605.42)pg/ml;且其表达水平与临床分期,是否远处转移及肝癌组织中是否阳性表达B7-H3等参数相关(P<0.05),与年龄,性别,组织学类型,淋巴结转移及肿瘤大小等临床病理参数无关；与血清学指标CA19-9呈明显正相关(P<0.05),但与AFP和CEA水平无相关性。结论：(1)B7-H3在肝癌组织中高表达,而不表达或低表达于正常肝组织；(2)在肝癌患者血清中,可溶性B7-H3的含量明显高于正常人,且其表达水平与肝癌临床常用病理指标明显相关。提示共刺激分子B7-H3可能参与了肝癌的病理进程,有望成为肝癌免疫治疗的新靶点。二、共刺激分子B7-H3在肝癌细胞株HepG2上的表达及意义目的：通过沉默共刺激分子B7-H3在肝癌细胞株HepG2中的表达,研究其在HepG2细胞上表达对HepG2细胞增殖、黏附、迁移、侵袭能力的影响及其在HepG2介导的对外周血CD8+T细胞免疫调节中的作用。方法：(1) RT-PCR、激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)及FCM检测B7-H3在HepG2细胞上的表达。(2)通过脂质体转染方式用化学合成的B7-H3shRNA转染HepG2细胞,RT-PCR及FCM检测转染48h后,B7-H3在基因及蛋白水平的表达。(3)沉默B7-H3后,CCK-8法检测HepG2细胞的增殖和黏附；划痕实验和Transwell细胞培养系统检测HepG2细胞在DMEM-HG完全培养基,培养条件下的迁移和侵袭作用。(4) Ficoll密度梯度离心法分离纯化人外周血T细胞,免疫磁珠分选法分选出CD8+T细胞,将其与HepG2细胞共培养,并用PHA或PMA刺激。(5)FCM分析CD8+T细胞早期活化表型CD69的表达及CD8+T细胞周期变化；细胞胞内染色法检测CD8+T细胞对IL-17的分泌。结果：(1)无论是基因水平还是蛋白水平,HepG2细胞均高表达B7-H3；(2)通过脂质体途径能够将PGPU6/GFP/neo-B7-H3shRNA质粒高效转染入HepG2细胞,且能有效沉默B7-H3的表达。(3)沉默B7-H3后,细胞的增殖能力较正常培养的细胞明显减弱,且在接种48h和72h后尤为明显；细胞接种0.5h,1h后其黏附能力未发生明显变化,但在接种3h后,其黏附能力明显低于正常培养的细胞(P<0.05)：沉默B7-H3后,其迁移和侵袭的细胞数明显低于正常培养细胞(P<0.05)。(4)FCM分析结果显示,肝癌细胞株HepG2对CD8+T细胞活化及周期均有抑制作用；阻断B7-H3的表达后,明显减弱HepG2细胞对CD8+T细胞早期活化表型CD69表达的抑制作用,且能够通过下调CD8+T细胞G0/G1期细胞数量,上调S期细胞数量逆转HepG2细胞对CD8+T细胞周期的阻滞作用；在HepG2存在条件下,CD8+T细胞对IL-17的分泌明显增加,阻断B7-H3的表达后,IL-17的分泌被进一步上调。结论：B7-H3参与了HepG2细胞的增殖,黏附,迁移和侵袭过程,并在HepG2细胞介导的对CD8+T细胞的活化、周期及分泌细胞因子的免疫调节中发挥重要的作用。