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细胞凋亡,又称为细胞程序性死亡。Bcl-2家族蛋白通过各种蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）,调节线粒体外膜通透性改变,调控细胞凋亡,在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。因此,抗凋亡Bcl-2蛋白被认为是癌症的重要靶标蛋白。2016年4月,ABT-199成为了首个获得FDA批准上市的Bcl-2抑制剂类抗癌药。但是,磷酸化修饰会引发Bcl-2家族蛋白构象的改变,重塑PPI网络,因此磷酸化的Bcl-2蛋白被认为是一个癌症治疗的新靶标。例如,在白血病细胞中,Bcl-2蛋白的磷酸化修饰导致Bcl-2抑制剂无法直接结合和抑制Bcl-2的抗凋亡功能,因此对ABT-199以及临床实验中的Obatoclax和S1等Bcl-2抑制剂产生耐药性。拮抗磷酸化Bcl-2蛋白的小分子,是潜在的抗癌新药。到目前为止,磷酸化Bcl-2蛋白结构研究的缺乏,是靶向磷酸化Bcl-2蛋白解决耐药的小分子药物研发的瓶颈问题。在Bcl-2蛋白结构研究中,使用Bcl-xl蛋白的部分loop区域替换Bcl-2蛋白的loop区域,获得较高溶解度、结构稳定的蛋白进行解析。但是,Bcl-2蛋白的磷酸化位点恰恰位于loop区域。因此无法在现有的Bcl-2蛋白结构基础上研究磷酸化Bcl-2蛋白的结构。只有解析磷酸化Bcl-2蛋白结构,才能准确揭示Bcl-2蛋白磷酸化修饰的意义,对于肿瘤的药物发现和肿瘤发生的病理过程具有重要价值。本文构建了一个包含loop区域模拟蛋白磷酸化的EEE-Bcl-2-EK（62-206）突变体,利用三维核磁共振、荧光偏振等实验,我们首次发现loop区的磷酸化位点pT69/pS70和Bcl-2蛋白的活性位点:BH3沟槽中的残基R106/R109的共同驱动构象变化,变构调节了BH3结合沟槽。同时,我们通过转染Bcl-2蛋白磷酸化修饰的突变体质粒等细胞生物学研究,证明了Bcl-2蛋白通过磷酸化修饰增强其抗凋亡的功能。基于磷酸化Bcl-2蛋白的结构,本研究在磷酸化Bcl-2抑制剂S1-6上侧链连接羧酸基团,获得靶向Bcl-2蛋白同时通过变构机制干预其磷酸化的小分子S1-6e。利用核磁共振和荧光偏振实验确证,S1-6e结合BH3沟槽并且其侧链的羧酸基团能与R106/R109发生相互作用。因此,S1-6e在结合Bcl-2的同时破坏了磷酸化位点pT69/pS70与R106/R109间的作用网络,从而促进了的Bcl-2蛋白去磷酸化。与之相符的是,细胞生物学实验证明相比于传统Bcl-2抑制剂,双功能的S1-6e在肿瘤细胞中表现出更强的杀伤活性。综上所述,本研究首次发现Bcl-2蛋白loop区域的磷酸化变构调节活性沟槽BH3的构象,调控Bcl-2蛋白抗凋亡功能,为解释Bcl-2抑制剂的耐药性提供了结构基础。通过对磷酸化修饰别构调节Bcl-2蛋白的分子基础的研究,我们设计了靶向Bcl-2蛋白变构调节剂S1-6e,并明确S1-6e与Bcl-2蛋白的结合模式,进一步证明了通过干预变构调节能够干预Bcl-2的磷酸化修饰。Bcl-2蛋白磷酸化修饰的变构调控和化学干预为人们认识蛋白磷酸化的意义,抗肿瘤新靶点的确认,和新的抗肿瘤治疗策略提供了科学依据。