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背景食管癌是全球范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一,病死率在全世界范围恶性肿瘤病死率中位于第六位。目前来看,食管癌发病率呈现逐年上升的趋势,高发区主要分布在土库曼斯坦、哈萨克斯坦、南非、法国等,我国也是食管癌高发地区,特别是我国北方一些省份,比如河南、河北、陕西等发病率高于全国平均水平。食管癌早期临床症状多不明显,而被病人或家属忽视,当大多患者出现较为明显症状而就医时,就已经表现为食管癌晚期,丧失完全切除肿瘤机会。近些年,食管癌的治疗方式(包括手术方式、放化疗方式及靶向治疗等)取得了长足进展,食管癌患者的生存和预后有了一定程度上的改善,但病死率依然很高。目前,总的食管癌病人5年生存率不及30%。目前食管癌对不同种类的细胞毒性药物出现了不同程度的耐药性,寻找新的食管癌肿瘤靶向作用位点及新的抗癌药为目前研究热点。对于新兴的抗癌药物来说,使用小分子类蛋白物质治疗恶性肿瘤是一个非常有前景的研究方向,此实验中,m/z 6455.5Da蛋白是一个具有功能肽片段的小分子蛋白。应用小分子蛋白类物质作为抗癌药的好处包括,可以进行人工合成,并可轻松地在肽的结构是进行人为的修饰。目前基于人们已经拥有对蛋白质微结构及功能的了解,科研工作者有能力去设计出一种新型的可以应用于肿瘤治疗的小分子蛋白。目前对小分子蛋白治疗肿瘤的研究集中在功能肽链研究上,其中包括两个方面:1,有些肽可以作为肿瘤靶向治疗的一个环节2,有些肽具有穿透肿瘤细胞膜的能力从而对肿瘤细胞产生细胞毒性。近年来的一些研究表明,拥有丛集疏水性和带有阳离子性质特征的双亲结构的抗菌肽(AMPs)具有杀死微生物的能力,并能对肿瘤细胞表现出很强的细胞毒性。这些肽可以聚集在细胞膜表面,破坏细胞膜或者细胞器膜,从而造成细胞的凋亡或是坏死。细胞膜穿透肽(CPPs)及肿瘤靶向肽(TTPS)他们对肿瘤细胞表面(比如细胞膜或肿瘤血管内皮细胞)拥有特异性标记的能力,可以作为承载抗癌药物的载体,对肿瘤细胞或者肿瘤血管的细胞质膜进行特异性靶向杀伤。目前的研究难点在治疗肽应用于临床试验方面,比如如何增加肽靶向作用于肿瘤的能力,搞清楚治疗肽药代动力学特性等等。目的探究m/z6455.5Da蛋白对食管癌TE1及EC109细胞的影响;初步探讨m/z6455.5Da蛋白影响食管癌细胞TE1和EC109细胞的作用通道;为m/z6455.5Da蛋白作为一种新兴药物应用于临床提供体外实验数据。材料与方法材料:m/z 6455.5Da蛋白来源于之前我课题组实验研究成果,食管癌TE-1,EC109细胞均购于中国科学院上海细胞库,复苏后在37℃,5%浓度CO2环境下,使用10%血清培养基进行持续培养,传代至少2次后,取生物活性较好的细胞进行试验。方法:获得状态良好的TE-1及EC109细胞后,按下列方法进行试验:(1)间接细胞免疫荧光:使用不同浓度的带有FITC荧光素标记的m/z6455.5Da蛋白分别处理Te-1细胞、Ec-109细胞,用细胞间接免疫荧光技术显示细胞核及细胞骨架,并对m/z 6455.5Da蛋白进行追踪定位。(2)细胞毒性试验:使用不同浓度的m/z 6455.5Da蛋白分别处理Ec109细胞、TE-1细胞,用Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)法检测并描绘细胞生长曲线,评价m/z 6455.5Da蛋白对食管癌细胞的干预效果。(3)流式细胞技术:使用不同浓度的m/z 6455.5Da蛋白干预EC109细胞、TE-1细胞后,分别制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后,分别分析不同剂量m/z 6455.5Da蛋白干预下食管癌细胞的早期凋亡、晚期凋亡的差异。(4)Western-blot蛋白印迹技术:提纯经不同浓度的m/z 6455.5Da蛋白干预两种食管癌细胞后的蛋白,进行定量分析后,经过制胶、电泳、转印、显色、成像等流程,最后通过蛋白免疫印迹术分析硝酸纤维膜上着色的位置和着色深度分析目的蛋白在食管癌细胞中的表达情况。结果1.间接细胞免疫荧光试验:m/z 6455.5Da蛋白在不同浓度及特定的作用时间下,均可与EC109细胞和TE-1细胞相作用,并且呈浓度依赖效应关系(P<0.001)。2.细胞毒性试验(CCK-8试验):m/z 6455.5Da蛋白在不同浓度及特定的作用时间下,对EC109细胞和TE-1细胞的增殖均有抑制作用,并且呈时间-浓度依赖效应关系(P<0.001)3.流氏细胞实验:在细胞凋亡检测中,随着载m/z 6455.5Da蛋白浓度的增加,凋亡的细胞逐渐增多,且与m/z 6455.5Da蛋白的浓度呈浓度依赖效应(P<0.05)。4.Western-blot实验:经过对特异性蛋白PCNA,BAX的显影提示,使用不同溶度的m/z 6455.5Da蛋白,此两种特异性蛋白表达呈现趋势性,其中PCNA的表达伴随类m/z 6455.5Da蛋白浓度的升高呈现出逐渐下降的趋势(P<0.05),而BAX蛋白的表达伴随m/z 6455.5Da蛋白浓度的升高,呈现出逐渐上升的趋势(P<0.05)。结论m/z 6455.5Da蛋白对食管癌细胞TE-1,EC109细胞均表现有抑制作用,使用浓度越高的m/z 6455.5Da蛋白对食管癌细胞进行干预,癌症细胞的抑制率越高。