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研究背景:目前有多种免疫检查点抑制剂在中国获批用于非小细胞肺癌的治疗,已极大改善了NSCLC患者的预后与全程管理。但只有不到20%的患者可以从ICIs长期获益,且约50%的患者存在免疫治疗相关毒性。因此需要通过bio-marker指导免疫治疗人群选择,以使NSCLC患者最大程度获益。研究目的:1.总结NSCLC人群免疫治疗真实世界数据,并利用常见临床指标分析预后相关因素,构建疗效预测模型。2.探索NSCLC人群免疫治疗疗效与特定肿瘤突变基因特征的关系。3.分析NSCLC免疫治疗肠道菌群结构及代谢组特征与ICIs疗效的关系,以期发现可增强免疫治疗疗效的菌群特征。实验方法:前瞻性分析2018年3月至2019年6月在北京协和医院呼吸内科就诊并遵嘱使用PD-1抑制剂的晚期非小细胞肺癌患者,随访截止至2019年12月31日。1.主要观察终点为OS和PFS,次要观察终点为ORR、DCR及安全性。按照实体瘤疗效评价标准(RECIST)1.1和国立癌症研究所毒性判定标准(NCI-CTC)4.0评价疗效和毒性。LASSO回归进行单变量分析,Cox回归分析用于多变量分析。使用R版本2.14.1的rms26软件包,制定疗效预测列线图。Kaplan-Meier法绘制无生存曲线。2.将有足够病理组织进行肿瘤突变基因及PD-L1检测的患者分为持久获益组(DCB,CR/PR/SD≥6个月)和非持久获益组(NDB,CR/PR/SD<6个月),使用卡方检验分析DCB/NDB的可能性与分子特征之间的关联。以DCB/NDB为结局变量,特定基因突变为自变量行lasso回归、logistic回归及机器学习随机森林分析,探索与免疫治疗持久获益相关的独立预测因素。Kaplan-Meier法绘制NSCLC免疫治疗患者特定基因突变与否的无进展生存曲线。绘制ROC曲线对预测能力做出评价。3.所有患者在免疫治疗开始前采集粪便样本,所有样本经过DNA extraction和文库 construction 后,用 Illumina Sequencing Platform 进行 shotgun 宏基因组测序,所有样本测序数据进入生物信息数据分析流程。所有数据依据PFS≥6个月和PFS<6个月分为2组。整个分析包括质量控制,组装,基因预测和构建非冗余基因集,基因功能注释,基因、物种和功能层面上的丰度定量,菌群组成分析,多样性分析,多维度分析,差异分析,功能分析以及代谢物分析等。实验结果:1.总计63例患者纳入本研究。中位年龄61岁,60岁以上36例。男性84.13%,重度吸烟史占46.03%,ECOG≤1分占92.07%,Ⅳ期占84.12%。所有患者均为病理确诊,接受一线免疫治疗32例,二线22例,三线及以上9例。使用药物包括pembrolizumab 42例,nivolumab 4例,信迪利单抗17例。患者从疾病确诊至开始免疫治疗间隔1至38个月,用药周期为1至35周期。最佳疗效PR 27例(42.8%),SD 14例(22.2%),PD 22例(34.9%)。客观缓解率为42.8%,疾病控制率为65.1%。脑转移患者8例,6例存在神经系统症状,经免疫治疗后颅内病灶评估PR 3例,SD 3例,PD 2例,免疫治疗脑转移患者ORR 37.5%,DCR 75%。至随访截止日期仍未见疾病进展者13例。至随访终点死亡14例。中位PFS 7.0个月(95%CI 5.0-11.0个月),未达中位OS。LASSO回归有意义的单因素为吸烟指数、PD-L1表达、NLR,将LASSO回归有意义的变量纳入到Cox比例风险模型中进行多因素分析,结果显示吸烟指数和NLR为影响免疫治疗PFS预后的独立因素。建立了包含NLR和吸烟指数的模型列线图,评分系统简称为非小细胞肺癌免疫治疗预后评分(Non small cell Lung cancer immunotherapy prognosis score,NSCLCIPS)。常见不良反应为皮疹、乏力、消化系统毒性、肺毒性、内分泌毒性、血液系统毒性、肝酶和胰酶升高。2.共44例患者有足够病理组织进行肿瘤突变基因及PD-L1检测,DCB组20例,NDB组 24 例。特定基因突变发生率为 TP53 38.64%、KRAS 31.82%、EGFR 20.45%、BRCA 20.45%、ERBB(除外EGFR)18.18%、PTEN 15.91%、CDK4/6 13.64%、POLE 11.36%、MET 11.36%、PIK3CA 9.10%、FGFR 9.10%、BRAF 9.10%、JAK 9.10%、ALK 6.82%、POLD1 4.55%、BLM 4.55%。卡方检验结果显示DCB和NDB组之间KRAS突变、KRAS+TP53组合突变、TP53+PTEN组合突变、PTEN突变、JAK1/2/3突变、TP53突变、EML4 ALK突变、Pan-ERRB突变频率有显著统计学差异。以是否持久获益为结局变量,基因突变为自变量行lasso回归,非零基因突变为KRAS、EML4-ALK、PTEN、TP53+PTEN。logistic回归显示KRAS突变具有统计学意义(P<0.001),随机森林分类的MeandecraseGini和Meandecreaseaccuracy两个准确性指标评价不同基因突变对结局影响重要性,在两个不同的衡量标准下,自变量的排序不完全一致,但是最重要的自变量都是KRAS基因突变。提示KRAS基因突变为免疫治疗是否持久获益的独立预测因素。3.根据PFS将患者分为PFS≥6个月组(35例)和PFS<6个月(28例),Illumina平台进行测序共得到共373.5G的原始测序数据。样本的reads数量在27,060,458-66,836,852 之间,平均 43,119,830。Bacteroidetes,Firmicutes,Proteobacteria及Actinobacteria占研究粪便样本中细菌群落的大部分。PFS≥6个月组患者与PFS<6个月组相比,在基线水平具有较高的肠道微生物组β多样性,有显著统计学差异。α多样性有较高的趋势,但未见统计学差异。两组之间的成分差异也存在,PFS≥6 个月组中富含 parabacteroides 和 methanobrevibacter,而PFS<6 个月组中富含 Veillonella、Selenomonadales、Negativicutes。用 DESeq2分析每个功能类群(包括K0,COG和CAZy)蛋白家族在组间相对丰度的差异,结果提示共有390个KO、264个COG、859个CAZy功能类群丰度在在PFS≥6个月组和PFS<6个月组具有显著性差异。基于相对丰度分布表,分析两组相对丰度差异明显的KO通路(TOP10),结果显示,ko02040 Flagellar assembly(鞭毛装配体)、ko02030 Bacterial chemotaxis(细菌趋化性)等5组代谢通路在PFS≥6个月组丰度较高。ko00680 Methane metabolism(甲烷代谢)、ko00362 Benzoate degradation(苯甲酸酯降解)等代谢通路在PFS<6个月组丰度较高。菌群代谢物提示提示PFS<6月组甲烷生成的潜力高于PFS≥6月组(P<0.05)。结论:1.PD-1抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌真实世界人群疗效及安全性较好。吸烟指数和NLR为影响免疫治疗PFS的独立预测因素,包含NLR和吸烟指数的模型列线图可预测病人的1年无进展生存率。2.肿瘤组织KRAS基因突变为免疫治疗是否持久获益的独立预测因素,且预测能力较好。3.中国晚期NSCLC患者肠道微生物组β多样性与抗PD-1免疫疗法反应之间的密切相关,PFS≥6个月和PFS<6个月的肠道菌群组成、功能类群蛋白家族、KEGG代谢通路及菌群代谢物均存在差异。