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研究背景:胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是成人颅内最常见的原发恶性肿瘤。虽然随着神经外科手术技术的提高以及放疗、化疗和生物治疗等综合治疗手段的运用,胶质母细胞瘤患者的预后仍然没有明显改善。GBM临床治疗的最大难点在于其几乎不可避免手术后肿瘤的复发,这与其向周围脑组织侵袭性生长导致手术无法彻底切除肿瘤有关。胶质母细胞瘤干细胞(gliblastoma stem cells,GSCs)是存在于GBM组织中的一小部分具有自我更新能力及高致瘤能力的恶性肿瘤细胞,被认为是胶质瘤发生发展以及手术切除后GBM复发的种子细胞。因此,深入探讨GSCs恶性生物学特性及潜在的调控机制,对寻找更有效的GBM治疗靶标具有极其重要的意义。神经降压肽(Neurotensin,NTS)是一种由13个氨基酸组成的短肽,广泛表达于中枢神经系统及消化系统。NTS的生理作用非常多样如炎症和疼痛反应调节,同时其在多种疾病的发生发展中也扮演着重要的角色,而其高亲和力受体NTR1参与介导了NTS的生理及病理作用。近年来研究发现NTS/NTR1信号的异常与人类多种恶性肿瘤如肺癌、结肠癌、前列腺癌等的发生发展关系密切。运用NTR1特异性拮抗剂SR48692能够明显抑制恶性肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭以及促进恶性肿瘤对治疗的敏感性。我们课题组的前期研究发现,NTS和NTR1在GBM中高表达,并且NTS和NTR1的表达与胶质瘤的WHO分级成正相关,与患者的预后成负相关。进一步研究结果则发现NTS及NTR1在胶质瘤中的高表达能促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。此外,有研究报道NTS在胶质瘤干细胞较贴壁培养的胶质瘤细胞中的表达明显上升,且参与了小胶质细胞向胶质瘤干细胞趋化运动的调节。以上研究提示NTS/NTR1信号对GSCs的恶性表型可能有着重要的影响,但究竟有何影响?又是通过什么样的分子机制参与了GSCs这些恶性生物学行为的调控?目前国内外尚未见报道,需要进一步深入的研究。目的:研究NTS/NTR1信号对GSCs自我更新及侵袭能力的影响及可能分子机制,分析NTS在GBM手术切除标本中的表达及其与临床病理参数的相关性,进一步明确nts/ntr1信号在gbm患者诊断及预后中的价值。材料与方法:1.应用无血清培养悬浮成球的方法从gbm患者手术切除组织标本及gbm细胞系中获取胶质母细胞瘤干细胞球。经过体外成球实验,流式细胞术及wb检测干性标记物(nestin和cd133)以及balb/c裸鼠体内成瘤实验鉴定gscs。2.利用nts、ntr1拮抗剂sr48692以及慢病介导的方法干扰ntr1的表达,采用transwell侵袭实验分析sr48692处理以及ntr1干扰后对gscs(u87-1,gp-1和gp-2)侵袭能力的影响,同时采用成球实验及有限稀释实验检测gscs的自我更新能力。利用流式细胞术及wb检测干性标记物的表达情况,进一步建立皮下以及颅内原位移植模型在体内明确nts/ntr1在gscs侵袭及自我更新能力中的调控作用。3.利用qrt-pcr检测ntr1干扰后gscs细胞因子的表达差异,进一步利用elisa对qrt-pcr的检测结果进行验证。4.通过使用外源性il-8、干扰和过表达il-8,采用transwell侵袭实验、体外成球实验、软琼脂克隆形成实验及检测干性标记物表达,检测il-8在nts/ntr1信号调控gscs侵袭及自我更新能力中的作用。裸鼠皮下移植瘤模型检测过表达il-8在ntr1敲低后gscs移植瘤的生长情况。5.通过wb检测nts/il-8对下游信号通路akt、erk1/2以及stat3的激活情况。利用cxcr1及cxcr2中和抗体以及si-cxcr1下调cxcr1的表达,通过transwell侵袭实验、成球实验、软琼脂克隆形成实验及干性标记物的表达检测cxcr1及cxcr2在gscs侵袭及自我更新能力中的作用。6.免疫组化检测临床gbm组织标本中nts、il-8、mmp2、mmp-9和hif1α的分布及表达、采用卡方检验分析nts与il-8表达的相关性,进一步分析nts和il-8与临床病理参数之间的相关性。采用wb检测nts高表达和nts低表达gbm组织中干性标记物sox2和oct3/4的表达情况。运用kaplan-meier生存分析预测nts的表达对gbm患者总生存时间及无疾病进展生存时间的影响。结果:1.应用无血清悬浮成球法成功从gbm细胞系u87及gbm手术切除组织标本中分离培养出gscs,高表达干细胞标记物cd133和nestin,体内皮下移植瘤实验也表明胶质瘤干细胞较贴壁培养的gbm细胞具有更强的的成瘤性。2.nts及ntr1在gscs较贴壁培养细胞表达升高。利用ntr1特异性抑制剂sr48692处理和慢病毒介导的ntr1干扰成功后,transwell侵袭实验、体外成球实验以及有限稀释实验结果显示gscs的侵袭能力和成球能力均明显下降。同时,流式细胞术及wb检测也发现gscs的干性标记物nestin、oct3/4、nanog、sox2的表达也明显下降。与之相反,在nts处理后gbm干细胞的成球能力明显升高。进一步皮下移植瘤及颅内原位移植瘤实验均证实在干扰ntr1后gscs的体内成瘤能力明显下降,颅内荷瘤小鼠的生存时间明显延长,干性标记物以及侵袭相关分子mmp-9的表达也明显下降。3.细胞因子荧光实时定量pcr结果表明,ntr1干扰后il-8在gscs中的表达明显下降。elisa的检测结果表明,在ntr1干扰后u87-gsc和gp-1gscs培养基上清中il-8蛋白的分泌明显减少。进一步的研究则证实nts对gscsil-8表达的调控是一个相对普遍的现象,且与egfr受体的活化密切相关。4.干扰il-8的表达能够明显抑制gscs(u87-gsc和gp-1)的侵袭及成球能力。进一步的研究发现在ntr1干扰的gscs中过表达il-8则能在很大程度上恢复下降的侵袭及克隆形成能力。裸鼠皮下移植瘤实验结果也证实过表达il-8则明显恢复ntr1干扰后gscs的成瘤能力.5.cxcr1/stat3参与了nts/il-8信号通路对gscs侵袭及自我更新能力的促进作用。利用nts及il-8处理后,gscs中p-stat3的表达增加,而akt和erk1/2则无明显变化。此外,干涉ntr1后gscs中p-stat3的表达则下降,而且il-8能够在一定程度上恢复ntr1干扰后p-stat3的下降。利用cxcr1及cxcr2的中和抗体处理gscs后,结果发现gscs侵袭及成球能力均明显下降,而p-stat3的表达则主要受到cxcr1的调控,而cxcr2对p-stat3却无明显的调控作用。进一步的研究则发现干扰cxcr1后,gscs的增殖、侵袭、成球能力以及干性标记物的表达均明显下降。6.免疫组化结果显示,nts,il-8及mmp-9主要表达于胞浆,hif1α主要表达于胞核。gbm组织中nts与il-8的表达呈正相关性,同时nts与il-8的表达均与与mmp-9和hif1α的表达成正相关,而与mmp-2则无明显的相关性。此外,我们的研究结果也发现mmp-2在本组gbm组织中呈明显的核表达,然而在whoi级及ii级胶质瘤却很比较少见。wb结果发现,在nts高表达的gbm组织中干性标记物sox2和oct3/4的表达较nts低表达的组织明显升高。kaplan-meier生存曲线分析结果发现gbm组织中高表达nts提示患者预后较差。结论:1.nts及ntr1在gscs高表达促进了gscs的自我更新及侵袭能力,证实了nts/ntr1在gscs恶性生物学行为中的重要调控作用。2.NTS/NTR1信号参与调控GSCs细胞因子IL-8的表达,其作用机制与EGFR受体的激活相关。3.NTS/NTR1通过激活IL-8/CXCR1/Stat3信号通路参与GSCs自我更新及侵袭能力的调控.4.GBM手术切除标本中NTS的表达与患者的预后成负相关,与IL-8的表达呈正相关。因此,对GBM中NTS表达的检测可作为胶质母细胞瘤患者预后评价的重要指标之一。