研究背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,占女性恶性肿瘤的25%[1],同时也是发达国家女性第二大死因[1]。我国近10余年发病率逐年攀升,在一些大中型城市,乳腺癌已然成为严重危害女性健康的最常见恶性肿瘤[3]。随着“乳腺癌是全身性疾病”这一观点的确立,相关化疗、内分泌治疗、靶向治疗的研究进展迅速;尤其是化疗,因其不受制于患者肿瘤的激素受体状态以及HER2表达状态,已成为乳腺癌辅助治疗以及解救治疗的首选方案。尽管乳腺癌的综合治疗发展迅速,疗效确切,但仍然难以阻止乳腺癌成为女性第二大恶性肿瘤相关死亡原因[4];这其中,肿瘤细胞对化疗的抗药性起了重要作用[5]。进展期乳腺癌患者常常伴有肿瘤对化疗药物的继发性耐药,进而导致化疗失败,肿瘤复发转移,从而严重影响患者的长期生存率。因此揭示乳腺癌细胞继发性化疗耐药的机制,进行预防和干预,对于提高乳腺癌患者的整体生存率至关重要。真核翻译起始因子-5A2(eukaryotic initiation factor-5A2,eIF-5A2)是 eIF5A 家族中的一员,是GuanXY[6]等从人卵巢癌细胞UACC-1598中分离出的新癌基因,其表达产物与eIF5A有84%同源性[7]。eIF-5A2仅在正常睾丸和脑细胞中有弱表达[7];但在部分肿瘤细胞内,如卵巢癌、结肠癌、膀胱癌,肝细胞肝癌等,却有较强的表达,近期的陆续相关研究更证实eIF-5A2的表达水平与部分肿瘤侵袭性及预后密切相关[8-13]。而我们前期研究发现:eIF-5A2很可能是乳腺癌的一个耐药相关基因。上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),即上皮细胞转化为间质细胞的过程,是诸如胚胎发育、伤口愈合等过程中的一个必不可少的基础过程。大量研究均证实,EMT在恶性肿瘤的侵袭、转移中发挥重要的作用[14,15],又与肿瘤耐药有密切关系[16-18]。目前,已有相关的研究证据表明,在部分恶性肿瘤中,eIF-5A2过表达能够促进肿瘤细胞的EMT[18,19]。综上所述,eIF-5A2是一个新发现的癌基因,相关研究目前还很少,尤其在乳腺癌方面尚属空白,但并不代表它在乳腺癌发生发展中并不重要;恰恰相反,结合相关文献报道以及我们的前期研究结果,我们完全有理由相信,eIF-5A2是一个乳腺癌耐药相关基因,本研究旨在揭露eIF-5A2与乳腺癌细胞对常用化疗药物敏感性的关系,并进一步探讨其引起乳腺癌细胞耐药的可能机制,并探索其作为治疗靶点逆转乳腺癌耐药的可能性。第一部分eIF-5A2与乳腺癌细胞化疗耐药的关系研究背景:eIF-5A2目前被认为是一个可能的致癌基因,在结直肠癌、肝细胞肝癌、非小细胞肺癌等肿瘤中表达往往异常增高,不少研究证实其与肿瘤的侵袭性及转移密切相关,是一个预后预测因子。而eIF-5A2在乳腺癌细胞中的表达以及与化疗耐药的关系目前尚无报道。目的:本研究目的在于揭示不同乳腺癌细胞株中eIF-5A2表达水平及其表达水平与化疗敏感性之间的关系。方法:取三种人乳腺癌细胞株(Bcap-1937(ER+)、HCC1937(ER-)、MCF-7(ER+)),分别测量每种细胞株中eIF-5A2的含量并进行比较。用eIF5A2-siRNA对不同乳腺癌细胞株进行处理,下调eIF-5A2表达,然后将处理后的乳腺癌细胞株暴露在不同浓度的多柔比星下,并用CCK-8检测乳腺癌细胞活性,并与eIF5A2-siRNA处理前乳腺癌细胞株对多柔比星的反应进行对比,以评估eIF-5A2对乳腺癌细胞敏感性的作用。结果:不同乳腺癌细胞株中eIF-5A2表达水平各异(其中ER阴性乳腺癌细胞表达显著高于ER阳性乳腺癌细胞),而不同乳腺癌细胞的eIF-5A2表达水平均与其对多柔比星的敏感性成负相关。使用eIF5A2-siRNA沉默乳腺癌中eIF-5A2的表达,则会显著提高乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性。结论:eIF-5A2在乳腺癌细胞中有不同水平的表达,主要在ER阴性乳腺癌细胞中表达较高,其在乳腺癌对多柔比星耐药的过程中可能发挥了重要作用。第二部分eIF-5A2引起雌激素受体阴性乳腺癌细胞耐药的机制研究背景:EMT被证实与多种肿瘤的耐药性相关,发生EMT的肿瘤细胞往往对化疗药物也更不敏感。目前已有研究发现eIF-5A2能够促进部分肿瘤细胞的EMT。我们上一研究初步证实eIF-5A2是乳腺癌细胞的耐药基因,且在ER阴性乳腺癌细胞中含量显著较高。目的:本研究的目的在于探讨eIF-5A2引起乳腺癌细胞耐药的机制,揭示其是否通过促进EMT来引起乳腺癌细胞的耐药。方法:取不同细胞系乳腺癌细胞(Bcap-1937(ER+)、HCC1937(ER-)、MCF-7(ER+))。用多柔比星诱导各乳腺癌细胞发生EMT,用GC7(N1-Guanyl-1,7-Diaminoheptane,eIF5A2活性抑制剂)进行干预,观察干预后细胞系的上皮、间质表型变化。用eIF5A2-siRNA干扰各乳腺癌细胞系的eIF-5A2表达,同样观察对比干预后的细胞系的上皮、间质表型变化。结果:对于雌激素受体阴性的乳腺癌细胞(HCC-1937),eIF5A2-siRNA、GC7均能逆转其EMT过程;而对于雌激素受体阳性的乳腺癌细胞(MCF-7、Becap-37),抑制eIF-5A2并不能改变其表型变化。结论:对于雌激素受体阴性的乳腺癌细胞,eIF-5A2很可能通过促进肿瘤细胞的EMT过程来调节乳腺癌细胞的耐药。第三部分GC7通过逆转eIF-5A2引起的EMT过程从而恢复雌激素受体阴性乳腺癌细胞对多柔比星敏感性的研究背景:多个研究证实eIF-5A2是个癌基因,GC7通过抑制其活性可以恢复部分肿瘤细胞对化疗的敏感性。我们前期研究发现eIF-5A2很可能通过EMT途径来调节雌激素受体阴性乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性,而对于雌激素受体阴性的乳腺癌细胞,GC7可以逆转eIF-5A2诱导的EMT。目的:观察GC7是否可以增强乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性;如果GC7与多柔比星有协同作用,探讨其作用机制。方法:取不同细胞系乳腺癌细胞(Bcap-1937(ER+)、HCC1937(ER-)、MCF-7(ER+)),分别用多柔比星或多柔比星+GC7来处理,对比两者之间细胞活性变化及细胞表型的变化。对各细胞系用eIF5A2-siRNA进行处理,沉默eIF-5A2表达后再分别用多柔比星或多柔比星+GC7来处理,对比两者之间细胞活性变化及细胞表型的变化。结果:对于雌激素受体阴性的乳腺癌细胞(HCC1937),GC7与多柔比星联合应用,能够显著加强后者对于乳腺癌细胞的毒性;而在雌激素受体阳性(MCF-7、Becap-37)的乳腺癌细胞中并未观察到如此显著的现象,即GC7对多柔比星的协同作用在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中并不明显。对于沉默eIF-5A2表达后的所有乳腺癌细胞,GC7都不能显著提高多柔比星的效果。结论:GC7可以通过逆转eIF-5A2引起的EMT来恢复雌激素受体阴性的乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性,而对于雌激素受体阳性的乳腺癌细胞,这一作用并不显著。总体结论:eIF-5A2是一个乳腺癌的耐药基因,在乳腺癌各细胞株中都有不同程度表达,尤其在雌激素受体阴性乳腺癌细胞中表达水平明显较高。eIF-5A2表达越高的乳腺癌细胞,对多柔比星就越不敏感;其引起激素受体阴性乳腺癌对化疗耐药的途径很可能是通过诱导乳腺癌细胞EMT。而作为eIF-5A2活性抑制剂的GC7,可以通过逆转eIF-5A2引起的EMT来恢复雌激素受体阴性的乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性。以上发现可以帮助我们进一步了解eIF-5A2相关的乳腺癌耐药,并为乳腺癌化疗耐药提供了一个新的潜在治疗靶点。