论文部分内容阅读
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率都位居世界前列。肝硬化是目前公认的主要死因之一,其发病率在未来很可能还会升高。近年来,随着医疗技术水平的不断提高,使我们拥有了日趋完善的诊断方法,成熟的外科手术,先进的医疗设备以及辅助性的化疗药物,甚至肝移植。但是患者的复发和转移问题仍然没能取得突破性的进展,其患者的预后不容乐观。进一步研究肝癌恶性生物学行为的调控机制,将为筛选肝癌预后标记物和靶向治疗靶点提供依据。蛋白质的泛素化和去泛素化状态是各种生物过程的关键决定因素,包括调节细胞周期、DNA修复、细胞凋亡、抗氧化特性和缺氧反应等,所有这些彼此之间直接或间接影响肿瘤的放射敏感性及细胞的抗辐射性。与此同时,泛素化/去泛素化系统的紊乱已经被报道与肿瘤的抗放射性有关。因此,阐明泛素介导的分子机制将为肿瘤治疗策略打开一个方法,提高肿瘤细胞放疗的敏感性。PRAJA1是一种E2依赖性的E3泛素连接酶,具有泛素-蛋白质的连接酶活性,属于一类包含指环结构的泛素连接酶。新近研究表明PRAJA1在脑组织中高表达,包括大脑皮质、小脑、额叶、枕骨等等,PRAJA1的异常表达与胶质瘤的发生发展相关。除此之外,在骨骼的发育中也起到非常重要的作用。但其在肿瘤中的机制研究较少,在肝癌中的作用尚不清楚,因此本论文主要研究了PRAJA1在肝癌中的作用,其主要结果如下:1.PRAJA1在肝癌中的表达水平及其生存分析:(1)通过免疫组化的方法进行肝癌组织染色,其结果显示相对于正常肝组织,PRAJA1在肝癌组织中高表达;(2)通过GEPIA数据库分析临床上PRAJA1的表达与肝癌病人生存情况的关系,相对于高表达PRAJA1的病人而言,低表达PRAJA1的病人生存期更长。2.PRAJA1对肝癌细胞增殖的影响:建立稳定过表达及敲除PRAJA1的肝癌细胞系,用MTS的方法和克隆形成的方法检测过表达和敲除PRAJA1之后对细胞增殖能力的影响,其结果显示,相对于对照组而言,过表达PRAJA1之后肝癌细胞的增殖能力增加,敲除PRAJA1之后肝癌细胞的增殖能力降低。3.PRAJA1对肝癌细胞迁移的影响:通过细胞划痕实验,检测过表达和敲除PRAJA1对细胞迁移能力的影响,其结果显示,相对于对照组而言,过表达PRAJA1之后肝癌细胞的迁移能力增强,敲除PRAJA1之后肝癌细胞的迁移能力减弱。4.药物处理对肝癌细胞中PRAJA1表达的影响:(1)采用索拉菲尼、褪黑素以及5种中药FM-8、FM-9、FM-14、FM-15、FM-16对肝癌细胞进行处理,筛选出处理后PRAJA1表达最低的FM-15;(2)选用FM-15,通过时间过程和剂量依赖分析肝癌细胞中PRAJA1表达水平变化,结果显示PRAJA1的表达随着FM-15处理时间的延长PRAJA1表达水平逐渐降低,且随着处理药物的浓度的加大其表达水平逐渐降低;(3)使用FM-15药物处理过的稳定过表达及敲除PRAJA1细胞系通过MTS方法测定其增殖能力,结果显示敲除PRAJA1并与药物联合处理后,能显著降低肝癌细胞的增殖能力。5.敲除PRAJA1之后的肝癌细胞对裸鼠成瘤能力的影响:用敲除PRAJA1的细胞系,采用皮下注射的方法对裸鼠进行成瘤实验,其结果显示,敲除PRAJA1之后,移植瘤的生长速度更慢,最后形成的移植瘤的体积更小且数量更少。6.Label-free定量蛋白质组学分析:配合高通量数据,利用非标记定量分析找到PRAJA1敲除后肝癌细胞中的差异表达蛋白,并通过Pathway显著性富集分析方法找出差异蛋白中的Pathway,以确定差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。综上所述,PRAJA1在肝癌组织中高表达,能促进肝癌细胞增殖和迁移;中药FM-15能够通过抑制PRAJA1表达进而抑制肝癌细胞的增殖;敲除PRAJA1之后能够抑制肝癌细胞的体内成瘤的能力,即PRAJA1作为促癌因子在肝癌中发挥作用。