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丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）级联途径是真核生物中保守的信号转导途径,可以响应各种生物、非生物胁迫,在植物生长发育、激素信号转导中发挥重要作用（Sheen 2001）。硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）作为一种重要的气体信号分子,积极参与调节植物生长发育和逆境响应。H2S通过介导S-硫巯基化修饰（S-persulfidation）调控蛋白质活性并传递信号,近年来较多研究表明H2S信号与植物MAPKs级联途径关系密切,但H2S介导S-硫巯基化修饰调控MAPKs家族成员蛋白活性,实现H2S信号和MAPKs级联途径交互调控的分子机制尚未明确。针对这一科学问题,本课题通过液质联用质谱（Liquid chromatography-MS/MS,LC-MS/MS）证明MPK10存在S-硫巯基化修饰,通过二级质谱明确MPK10修饰位点;通过改良生物素置换法验证S-巯基化修饰的可靠性;通过体外磷酸化实验证明MPK10存在自磷酸化活性和激酶活性;通过蛋白互作研究技术鉴定出与MPK10互作的底物BES1（bri1-EMS-suppressor 1）;最后通过构建转基因遗传学株系证明H2S信号通过MPK10蛋白的S-硫巯基化修饰延缓叶片衰老。最终阐明H2S介导的S-硫巯基化修饰调控拟南芥MPK10活性的机制。本研究主要结论如下:1.证明拟南芥MPK10蛋白存在S-硫巯基化修饰并确定修饰位点。克隆拟南芥MPK10基因,原核表达并纯化体外重组蛋白HIS-MPK10-SUMO。利用高分辨液质联用质谱仪证明MPK10上存在S-硫巯基化修饰,利用二级质谱分析明确S-巯基化修饰位点。2.为了验证S-巯基化修饰的可靠性,本研究对MPK10的半胱氨酸残基进行突变,通过丙氨酸（alanine,A）代替半胱氨酸（cysteine,C）模拟去S-硫巯基化修。通过改良生物素置换法（Modified Biotin Switch Method,MBSM）对野生型（wild type,WT）和突变体MPK10蛋白进行S-硫巯基化修饰分析。结果发现Na HS（H2S供体）以剂量依赖性方式增强MPK10WT蛋白S-硫巯基化修饰水平,证明MPK10蛋白S-硫巯基化修饰真实可靠。通过检测S-硫巯基化目标位点突变蛋白MPK10CSSH-A和其它位点突变蛋白(AtMPK10C1-A、AtMPK10C2-A和AtMPK10C3-A),发现MPK10CSSH-A蛋白修饰消失,其它位点突变蛋白修饰不变,证明已确定的S-巯基化修饰位点真实可靠。3.通过体外磷酸化实验证明S-巯基化修饰对MPK10自磷酸化活性的影响。Na HS处理可以抑制MPK10WT自磷酸化活性,并存在剂量依赖性抑制效应。S-硫巯基化修饰同样抑制AtMPK10C1-A、AtMPK10C2-A和AtMPK10C3-A突变体自磷酸化活性,但抑制效果在MPK10CSSH-A突变体消失。以上结果证明S-硫巯基化修饰通过特异性的半胱氨酸残基抑制激酶蛋白自磷酸化活性。4.本课题利用激酶通用底物髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）和MPK10体内天然底物转录因子BES1,检测S-巯基化修饰对MPK10底物磷酸化活性的影响。通过体外激酶实验检测H2S对AtMPK10激酶活性的影响,结果发现Na HS处理同样能以剂量依赖性方式抑制AtMPK10底物磷酸化水平,但抑制效果在MPK10CSSH-A突变体消失。综上,证明S-硫巯基化修饰同样通过特异性的半胱氨酸残基抑制MPK10蛋白底物磷酸化活性。5.以拟南芥mpk10突变体植株为背景,本研究构建了MPK10基因回补株系(mpk10/35S-MPK10WT)和S-硫巯基化位点定点突变体株系(mpk10/35S-MPK10CSSH-A),并筛选获得纯合遗传学材料。通过离体叶片衰老实验比较各实验组间衰老率。与WT相比,mpk10突变体株系叶片出现延缓衰老的现象。基因回补株系mpk10/35S-MPK10WT部分回补了mpk10衰老表型。Na HS和油菜素内酯（brassinolide,BL）处理延缓遗传材料叶片衰老。点突变遗传株系mpk10/35S-MPK10CSSH-A对延缓叶片衰老的响应减弱,证明H2S信号通过MPK10蛋白的S-硫巯基化修饰延缓叶片衰老。6.MPK10通过磷酸化目标底物发挥作用,本课题通过双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）和萤火素酶互补实验（Luciferase Complementation Assay,LCA）证明MPK10和转录因子BES1在体内互作。通过激光共聚焦显微镜观察到MPK10和BES1的互作定位于细胞核。