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化石燃料的快速消耗以及环境的污染,使得开发新能源,减轻环境压力势在必行。氢能源的高效及燃烧后无污染的特性使其成为人们开发新能源的焦点。其中以木质纤维素为基质的微生物发酵产氢是生物制氢领域最值得关注的研究方面。将木质纤维素转化为可发酵性糖并进一步用于微生物发酵产氢的过程调控往往与微生物菌种及其利用还原糖产氢的代谢途径相关。本文针对实验室前期获得的一株高产氢细菌Klebsiella sp.,克隆并超量表达该菌株生物氢合成途径中的关键酶基因——[Ni-Fe]氢酶大亚基hycG基因和甲酸氢裂解酶大亚基fhl基因,拟获得代谢途径优化、能高效发酵稻草水解糖液产氢的基因重组菌株,并阐释这两个基因超量表达对菌株生物氢合成相关途径代谢流分布的影响。研究内容与取得的成果如下:(1)首先探讨了镍离子对克雷伯氏菌产氢的影响,结果表明Ni2+以一定浓度添加至Klebsiella sp.发酵木质纤维素水解液产氢体系可获得提高的累积产氢量,证实Ni2+通过改变[Ni-Fe]氢酶活性可促进生物氢的合成。因此,克隆了Klebsiella sp.的[Ni-Fe]氢酶大亚基hycG基因,成功构建了原核表达载体pET-28a-hycG,进一步实现了该基因在Klebsiella sp.中的同源超量表达。该基因重组菌RT-H用于发酵稻草水解液产氢,可获得累积产氢量达4034.1 mL/L,较之野生菌株WT提高了 14.5％,对累积产氢量进行动力学拟合的结果亦表明RT-H发酵产氢过程中有更高的产氢潜力P和最大产氢速率Rm,由此表明,hycG基因的表达有利于菌株产氢量的提高。对氢酶活性的监测结果亦证实hycG基因的表达有利于菌株氢酶活性的提高从而促进产氢,尤其是发酵24～48 h,RT-H的氢酶活性较之WT提高23%～27%。此外,hycG基因的表达亦引起不同发酵阶段代谢物谱和代谢流分布的改变,尤其引起RT-H中丙酮酸代谢率和甲酸消耗率显著高于WT,说明该基因表达可能会增强生物氢合成支路的代谢流分布。(2)基于对Klebsiella sp.产氢代谢途径的分析,克隆了该菌株的甲酸氢裂解酶大亚基fhl基因。成功构建了原核表达载体pET-28a-fhl,并获得了超量表达甲酸氢裂解酶大亚基fhl基因的重组菌RT-F的。该菌株在发酵稻草水解糖液产氢过程中具有较强的产氢能力,其累积产氢量相较于野生菌提高了 24.8%,达4396.4 mL/L。对累积产氢量进行动力学拟合的结果亦证实该菌株具有较之WT更高的产氢潜力和最大产氢速率,分别可达4289.6 mL.L-1、89.47 mL.L-1.h-1。RT-F的甲酸氢裂解酶活性在发酵24 h达峰值且显著高于WT的,说明fhl基因表达引起了发酵早期甲酸氢裂解酶活性的提高,从而有利于发酵早期生物氢的合成。此外,RT-F胞内外甲酸消耗率显著高于WT表明fhl基因表达可能使得甲酸快速裂解产生氢气,有利于生物氢的早期合成。(3)构建了共表达镍铁氢酶大亚基hycG基因和甲酸氢裂解酶大亚基fhl基因的重组菌株RT-FH。采用该菌株进行发酵稻草水解糖液产氢,结果显示,RT-FH的累积产氢量相对于WT提高了 19.7%,达4227.6 mL/L。并且,在发酵初期重组菌具有较高的产氢速率,至发酵72 h,已有高达总产氢量96%的氢气积累。此外,fhl和hycG基因共表达亦引起不同发酵阶段代谢物谱和代谢流分布的改变。与WT相比,RT-FH具有较低的乙醇代谢量,并且提高了胞内甲酸的产量以及胞外甲酸的消耗。