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子痫前期（Pre-eclampsia, PE）是一种妊娠期特发性的全身性疾病，表现为孕妇妊娠20周后突发高血压，并伴随蛋白尿和/或全身多器官损伤。该病危害多，不仅伴发胎儿宫内生长受限/低出生体重儿、早产等，且PE患者后代成年后罹患中风、心血管、精神等疾患的风险高，是威胁孕妇、胎儿健康的严重疾病。PE临床表现错综复杂，各器官、系统损坏一触即发，目前针对PE尚无有效的干预手段，迅速娩出胎盘仍是唯一治疗方法。普遍认为妊娠期滋养层细胞侵袭不足导致子宫螺旋动脉重铸不良引起胎盘发育异常和功能受损是PE发病的中心环节，但胎盘发生期间导致滋养层细胞侵袭不足的机制仍未阐明。 课题组前期通过 cDNA表达谱芯片技术筛选发现核糖体蛋白 S4， Y连锁1基因（Ribosomal protein S4 Y-linked1，RPS4Y1）在子痫前期胎盘组织中的表达较正常妊娠晚期胎盘组织显著升高。RPS4Y1基因编码的蛋白是进化保守的核糖体蛋白 S4E家族的一个成员，为构成细胞核糖体40s小亚基的蛋白之一，该基因功能异常在特纳综合征患者中扮演了重要作用。近期研究发现，整个妊娠期所有类型绒毛滋养层细胞均有RPS4Y1蛋白表达且主要集中在胎盘的绒毛表面。然而，RPS4Y1是否调控胎盘滋养层细胞的侵袭？扮演何种作用？还有待研究。因此，本课题将探索 RPS4Y1在胎盘滋养层细胞侵袭行为中扮演的角色及可能分子机制，以期探讨RPS4Y1在PE发病中的作用和机制，为临床上进一步认识滋养层细胞侵袭能力受损的机制以及其干预治疗提供一定的理论依据。 第一部分：RPS4Y1在子痫前期胎盘中的表达及其意义 目的： 以不同时期人正常胎盘组织、子痫前期（PE）胎盘组织为研究对象，检测RPS4Y1蛋白的表达情况探讨 RPS4Y1在子痫前期胎盘中的表达及其意义。 方法： （1）采用qRT-PCR技术验证正常妊娠晚期胎盘组织、PE胎盘组织中RPS4Y1的cDNA芯片筛选结果； （2）采用免疫荧光双标法检测RPS4Y1在正常妊娠晚期胎盘组织、PE胎盘组织中的表达分布； （3）采用免疫组织化学法检测RPS4Y1在正常妊娠不同时期胎盘组织、PE胎盘组织中的表达及定位； （4）采用Western blotting检测RPS4Y1在正常妊娠不同时期胎盘组织、PE胎盘组织中的表达情况。 结果： （1）qRT-PCR结果显示RPS4Y1 mRNA在PE胎盘组织中表达较正常妊娠晚期胎盘组织表达显著升高（P＜0.05），与 cDNA表达谱芯片结果一致； （2）免疫荧光双标结果显示 RPS4Y1与 CK7共定位于妊娠期胎盘绒毛组织滋养层细胞中。 （3）免疫组织化学结果显示正常妊娠早期胎盘绒毛组织和蜕膜组织中均有 RPS4Y1蛋白表达，主要定位于胞浆；在胎盘绒毛组织中细胞滋养细胞、合体滋养细胞和滋养细胞柱均有较强表达；在胎盘蜕膜组织中绒毛外滋养细胞高表达，蜕膜间质细胞低表达。 （4）Western blotting结果显示RPS4Y1蛋白在人正常妊娠早期胎盘组织中的表达明显比正常妊娠晚期胎盘组织表达高(P＜0.001)；RPS4Y1蛋白在PE胎盘组织中的表达较正常妊娠晚期胎盘组织明显升高(P＜0.01)。 结论： （1）妊娠期RPS4Y1蛋白表达主要定位于胞浆，妊娠期胎盘绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞、滋养细胞柱以及蜕膜绒毛外滋养细胞中均有较强表达。 （2）RPS4Y1蛋白在人PE胎盘组织中表达显著增高，可能在调控滋养细胞功能和胎盘形成过程中发挥重要作用。 第二部分：RPS4Y1对胎盘滋养层细胞迁移和侵袭行为的影响 目的： 以不同的人滋养层细胞系和人早孕绒毛外植体为研究对象，研究RPS4Y1在人滋养细胞迁移和侵袭行为调控中的影响。 方法： （1）采用Western blotting法检测RPS4Y1在HTR8/SVneo，JAR， JEG-3和BeWo滋养层细胞中的表达。 （2）采用 CCK-8细胞增殖实验检测人妊娠早期绒毛外滋养细胞HTR8/SVneo干扰或者绒毛膜癌细胞JAR过表达RPS4Y1基因后的细胞增殖情况； （3）采用流式细胞术检测 HTR8/SVneo干扰或者 JAR过表达RPS4Y1基因后的细胞凋亡情况； （4）采用Transwell小室Matrigel侵袭实验检测HTR8/SVneo干扰或者JAR过表达RPS4Y1基因后的细胞侵袭能力变化情况； （5）采用人妊娠早期绒毛外植体培养模型研究干扰RPS4Y1基因后对绒毛外滋养细胞外生性迁移的影响。 结果： （1）Western blotting结果显示四种人滋养层细胞中均有RPS4Y1表达，RPS4Y1在HTR8/SVneo细胞中高表达，在JAR细胞中低表达，在JEG-3和BeWo滋养层细胞中呈中等表达。 （2） CCK-8结果显示 HTR8/SVneo细胞感染慢病毒携带的RPS4Y1基因 shRNA后的第24h、48h、72h呈现的细胞生长曲线， RPS4Y1 shRNA组与对照组Scramble shRNA组比较，在慢病毒感染72h后细胞生长速度加快（P＜0.01）；JAR细胞转染RPS4Y1过表达质粒的第24h、48h、72h呈现的细胞生长曲线，RPS4Y1组与对照组Vector组比较，在72h时细胞生长速度减慢（P＜0.05）。 （3）流式细胞术结果显示 HTR8/SVneo细胞感染慢病毒携带的RPS4Y1基因shRNA后，RPS4Y1 shRNA组与对照组Scramble shRNA组比较，细胞凋亡无显著差异（P＞0.05）；JAR细胞转染RPS4Y1过表达质粒后，RPS4Y1组与对照组 Vector组比较，细胞凋亡无显著差异（P＞0.05）。 （4）Transwell小室Matrigel侵袭实验显示HTR8/SVneo细胞感染慢病毒携带的RPS4Y1基因shRNA后，RPS4Y1 shRNA组与对照组Scramble shRNA组比较，细胞侵袭能力增加（P＜0.01）；JAR细胞转染RPS4Y1过表达质粒后，RPS4Y1组与对照组Vector组比较，细胞侵袭能力减弱（P＜0.05）。 （5）人妊娠早期绒毛外植体培养模型显示绒毛外植体感染慢病毒携带的RPS4Y1基因shRNA后，RPS4Y1 shRNA组与对照组Scramble shRNA组比较，绒毛外滋养细胞迁移能力增加（P＜0.01）。 结论： 人妊娠早期绒毛外滋养细胞株 HTR8/SVneo干扰RPS4Y1基因表达后细胞增殖加快，侵袭能力增加，细胞凋亡无影响；人绒毛膜癌细胞株JAR过表达RPS4Y1基因后细胞增殖减弱，侵袭能力减弱，细胞凋亡无影响。 第三部分：RPS4Y1调控滋养细胞功能在子痫前期发病中的机制初探 目的： 以人妊娠早期绒毛外滋养细胞系 HTR8/SVneo和绒毛膜癌 细胞系JAR为研究对象，探究 RPS4Y1在滋养细胞增殖以及迁移、侵袭生物学行为中可能涉及的机制。 方法： （1）采用Western blotting检测HTR8/SVneo细胞干扰或者JAR细胞过表达RPS4Y1基因后，p-STAT3、STAT3的表达情况； （2）设计“功能回复实验”，在RPS4Y1基因沉默的HTR8/SVneo细胞中转染STAT3 siRNA，将实验分为Scramble shRNA+Scramble siRNA组、Scramble shRNA+STAT3 siRNA组、RPS4Y1 shRNA+Scramble siRNA组、RPS4Y1 shRNA+ STAT3 siRNA组，采用CCK-8细胞增殖实验检测细胞增殖情况；采用Transwell小室Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭能力变化情况；采用Western blotting法检测RPS4Y1、p-STAT3、STAT3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达情况；采用免疫荧光检测RPS4Y1、p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的表达情况； （3）在人正常妊娠晚期胎盘组织和子痫前期胎盘组织中采用Western blotting法检测p-STAT3、STAT3的表达情况。 结果： （1）Western blotting结果显示HTR8/SVneo细胞感染慢病毒携带的RPS4Y1基因shRNA后，RPS4Y1 shRNA组与对照组Scramble shRNA组比较，p-STAT3表达显著增加；JAR细胞转染RPS4Y1过表达质粒后，RPS4Y1组与对照组 Vector组比较，p-STAT3表达显著降低。 （2）在 HTR8/SVneo细胞“功能回复实验”中，与 Scramble shRNA+Scramble siRNA组相比，Western blotting结果显示RPS4Y1 shRNA+ Scramble siRNA组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著升高，外源性沉默 STAT3能够逆转 RPS4Y1蛋白敲降引起的 p-STAT3、N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高；CCK-8细胞增殖实验结果显示感染慢病毒携带的RPS4Y1基因shRNA72h后RPS4Y1 shRNA+Scramble siRNA组细胞生长速度加快，外源性沉默STAT3能够逆转RPS4Y1蛋白敲降引起的细胞生长加快；Transwell小室 Matrigel侵袭实验结果显示RPS4Y1 shRNA+ Scramble siRNA组的细胞侵袭能力明显增加，外源性沉默STAT3能够逆转RPS4Y1蛋白敲降引起的细胞侵袭能力增加；免疫荧光检测结果显示RPS4Y1 shRNA+ Scramble siRNA组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高，外源性沉默STAT3能够逆转RPS4Y1蛋白敲降引起的p-STAT3、N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高。 （3）Western blotting结果表明p-STAT3表达水平在子痫前期胎盘组织中显著降低。 结论： RPS4Y1介导STAT3/EMT通路调控HTR8/SVneo细胞增殖、侵袭；RPS4Y1异常高表达抑制STAT3/EMT通路导致滋养细胞迁移侵袭能力减弱可能在子痫前期发病中扮演重要作用。