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A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染人会诱发宿主的天然免疫应答,通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)和RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)等模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)介导的信号通路,诱导I型干扰素和其他细胞因子的产生,刺激下游干扰素刺激基因(IFNstimulated genes,ISGs)的表达,从而发挥抗病毒作用。IAV在与宿主的共同进化过程中,发展出多种免疫逃避机制以躲避宿主的免疫应答。非结构蛋白NS1(Nonstructural protein 1,NS1)是流感病毒免疫逃避最重要的蛋白,可通过结合病毒ds RNA、靶向RIG-I及E3泛素酶TRIM25和Riplet、抑制抗病毒ISGs活性和宿主细胞m RNA的加工等方式抑制宿主的IFN应答。近年来,在NS1拮抗宿主免疫应答机制方面取得众多进展,但是仍有许多问题没有准确答案,值得深入研究。本研究将H5N1/HM流感病毒NS1蛋白的功能结构域进行分段,探讨其N端RNA结合结构域(RNA-binding domain,RBD)和C端效应结构域(Effector domain,ED)在拮抗RIG-I信号通路中发挥的作用,内容如下:1.H5N1 NS1蛋白的C端效应结构域抑制RIG-I介导的IFN-β产生将NS1截短为N端的1-73 aa和1-125 aa以及C端的74-225 aa和126-225 aa,在不同刺激条件下,考察截短体对IFN-β启动子活性的影响。在RIG-I或RIG-I(N)刺激下,NS1/74-225和NS1/126-225与全长NS1显著抑制IFN-β启动子活性,而NS1/1-73和NS1/1-125没有抑制作用;但是在病毒或ds RNA刺激下,所有截短体都抑制IFN-β启动子的激活,说明NS1-RBD抑制IFN依赖于RNA,而NS1-ED能以RNA结合非依赖的方式抑制IFN应答。随后通过检测NS1/126-225对RIG-I(N)介导的IRF3磷酸化、IRF3二聚体的形成和IRF3入核以及对IFN-β分泌的影响,进一步确认了C端效应区NS1/126-225抑制IFN-β产生的效应。2.NS1/126-225靶向TRAF3阻碍MAVS-TRAF3复合物的形成我们推测NS1/126-225可能作用于RIG-I信号通路的某个环节,通过IFN-β启动子报告基因实验、荧光定量PCR和ELISA实验证明了NS1/126-225抑制IFN-β产生位于MAVS和TBK1之间。Co-IP实验表明,NS1/126-225与TRAF3存在相互作用,NS1也能结合TRAF3,并在H5N1/HM病毒感染的A549细胞、HEK293T细胞和鼠原代巨噬细胞中验证了NS1与内源性的TRAF3存在相互作用,但是这种相互作用具有毒株特异性。在TRAF3敲低的细胞中,NS1/126-225对RIG-I(N)介导的IRF3磷酸化和IFN-β转录的抑制作用丧失,进一步证明TRAF3是NS1/126-225抑制IFN产生必需的。更深的分子细节是NS1/126-225与TRAF3的TRAF domain结合,阻碍TRAF3-MAVS复合物的形成。此外,NS1/126-225还能促进Se V感染早期MAVS对IKKε的招募,最终抑制RIG-I信号通路激活和细胞抗病毒应答。3.NS1/126-225抑制TRAF3的K63泛素化本研究还发现NS1/126-225能抑制TRAF3的K63泛素化。因其本身没有调节蛋白泛素化修饰改变的能力,NS1/126-225可能通过招募去泛素酶来切割TRAF3上的K63泛素链或抑制E3泛素酶结合到TRAF3。DDX3是一种RNA解旋酶,能促进TRAF3的K63泛素化并且能与NS1发生相互作用。在沉默DDX3后,NS1/126-225仍然抑制TRAF3的泛素化,但是病毒感染下对TRAF3泛素化的抑制作用不显著,说明NS1利用DDX3抑制了TRAF3的K63泛素化。4.NS1突变的病毒HM-Mut诱导高水平的IFN-β产生NS1缺失126-225位氨基酸的突变病毒HM-Mut与野生型病毒相比在A549细胞的复制能力显著下降,诱导IFN-β和ISGs的能力则显著增强。此外,我们发现PR8病毒编码的NS1 N端截短体t NS1能与TRAF3相互作用,抑制IFN-β和ISG表达。沉默TRAF3后,突变病毒PR8/M79.81I拮抗IFN的能力以及复制能力与野生型病毒没有显著差异,这一结果很好的补充了本研究的结论。本研究首次阐明NS1蛋白的C端效应结构域(ED)逃避宿主天然免疫应答的机制,为流感病毒与宿主先天免疫的相互作用提供了新见解,同时为抗病毒药物的开发提供一个潜在的目标。