论文部分内容阅读
目的:糖尿病肾病(DKD)是糖尿病常见的微血管并发症,是终末期肾病最常见的病因之一。中国作为糖尿病大国,目前的患病人数已经超过1亿,而糖尿病肾病也成为影响国人生活质量和寿命的重要疾病。临床上可观察到糖尿病患者常伴有脂质代谢的异常,糖尿病肾病患者肾脏组织中也检测到有脂质的沉积,脂类代谢的紊乱可能是导致糖尿病肾病的原因之一。但是高糖对细胞内脂质沉积的影响机制目前还不清楚。本研究以人肾小球血管内皮细胞(HGVECs)为研究对象,采用RT-qPCR、蛋白质免疫印迹(WB)、基因芯片等技术手段探究高糖对细胞内脂质沉积的影响,并明确其具体的机制。方法:1、水溶性胆固醇模拟体内高脂环境HGVECs给予胆固醇(0μg/ml;200μg/ml;400μg/ml;600μg/ml;800μg/ml)干预细胞12h、24h、48h后进行CCK8实验检测细胞的活性,筛选出合适的胆固醇干预浓度和干预时间。2、硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)的含量HGVECs给予胆固醇(0μg/ml;200μg/ml;400μg/ml;600μg/ml;800μg/ml)干预细胞24h后,检测胆固醇对内皮细胞NO合成和分泌的影响。3、高脂模型的验证以及不同糖浓度对细胞内脂质沉积的影响HGVECs给予胆固醇(0μg/ml;200μg/ml;400μg/ml;600μg/ml;800μg/ml)干预细胞24h后,通过油红O染色和胆固醇定量实验检测细胞内脂质沉积的情况。然后分为低糖组、高糖组、高胆固醇组和高糖高胆固醇组,分别干预24h,观察高糖对细胞内脂质沉积的影响。4、高糖高胆固醇对ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)和低密度脂蛋白受体(LDLR)表达的影响HGVECs分为低糖组、高糖组、高胆固醇组和高糖高胆固醇组,分别干预24h后,通过RT-qPCR、WB和细胞免疫荧光检测ABCA1和LDLR的mRNA和蛋白水平的表达,观察高糖高胆固醇对ABCA1以及LDLR的影响。5、HGVECs中调控ABCA1表达的转录因子的筛选HGVECs分为低糖组、高糖组、高胆固醇组和高糖高胆固醇组,分别干预24h后,通过RT-qPCR、WB检测ABCA1相关转录因子的表达情况。筛选出LXRs进行下一步深入研究。6、LXRs激活剂GW3965对ABCA1表达的影响HGVECs给予GW3965(0μmol/ml;0.5μmol/ml;1μmol/ml;2μmol/ml;4μmol/ml)干预细胞12h、24h、36h后RT-qPCR和WB检测ABCA1的表达情况。7、验证高糖通过LXRs影响ABCA1的表达HGVECs分为正常对照组、高胆固醇组、高糖高胆固醇组和高糖高胆固醇组+GW3965组,分别干预24h后,RT-qPCR检测ABCA1的表达。8、寻找在LXRs调控ABCA1转录过程中参与其中的长链非编码RNA(LncRNA)并进一步探究其作用机制HGVECs分为空白对照组和GW3965组,干预细胞12h后进行基因芯片检测,寻找差异的LncRNA,并通过RT-qPCR验证基因芯片的结果。利用siRNA敲低LncRNA的表达,HGVECs分为正常对照组、GW3965组、GW3965组+LncRNA-siRNA组,100nM siRNA转染48h,GW3965干预24h后,RT-qPCR检测ABCA1的表达。结果:1.CCK8实验结果显示:与正常对照组相比,胆固醇干预后细胞的活性下降,且胆固醇的这种影响呈现时间依赖性和浓度依赖性。2.NO含量测定结果显示:与正常对照组相比,各组胆固醇干预后细胞NO含量的改变没有统计学差异。3.油红O染色和胆固醇定量实验结果显示:不同浓度的胆固醇干预24h后均可见细胞内脂质的沉积,且随着胆固醇浓度的增加,细胞内脂质的沉积量也增加。与单纯高胆固醇组相比,高糖高胆固醇组的脂质沉积更加明显。4.RT-qPCR和WB结果显示:与正常对照组相比高胆固醇组ABCA1水平的表达明显增加,LDLR的表达量下降,但是与单纯高胆固醇组相比,高糖加高胆固醇组ABCA1表达量下降,LDLR的表达量增加。5.RT-qPCR和WB结果显示:与正常对照组相比,高胆固醇组LXR-α、LXR-β、FXR、RXRα和RXRβ的表达均明显增加,SREBP2的表达量下降,但是与单纯高胆固醇组相比高糖加高胆固醇组LXR-α、LXR-β、RXRα和RXRβ表达量下降,FXR的mRNA水平改变无统计学差异,蛋白水平明显下降,SREBP2的mRNA水平表达量增加,蛋白水平下降。6.RT-qPCR和WB结果显示:与空白对照组相比,GW3965干预组ABCA1的表达量增加。7.RT-qPCR和WB结果显示:与高糖高胆固醇组相比,高糖高胆固醇组+GW3965组ABCA1表达量增加。8.基因芯片的结果显示:GW3965组ABCA1的表达上调;两组间差异mRNA的分析显示,差异基因主要集中在参与脂类代谢的调节。9.RT-qPCR对基因芯片中差异LncRNA的验证结果显示:LncRNAOR13C9在GW3965干预组中明显上升。10.RT-qPCR结果显示:转染LncRNAOR13C9 siRNA后,与对照组相比,siRNA组LncRNAOR13C9的表达量降低;敲低LncRNAOR13C9的同时再给予GW3965干预后,与未敲低LncRNAOR13C9组相比,ABCA1的表达量有下降趋势。结论:1.HGVECs在高胆固醇负荷下会导致细胞内胆固醇沉积,进而影响细胞活性,而高糖会加重这一过程。2.HGVECs在高胆固醇负荷下会通过上调ABCA1的表达将过量的胆固醇排出细胞外,而高糖通过干扰细胞的这种自我调节,阻碍ABCA1的上调来加重胆固醇在细胞内的沉积。3.高糖可通过转录因子LXRs来影响ABCA1的表达,且LncRNAOR13C9在这一过程中也发挥重要作用。