目的:人类肠道病毒属于小RNA病毒科,肠道病毒属,是单股正链RNA的无包膜病毒,目前已经发现的肠道病毒有100多种,是导致儿童手足口病的主要病原体之一。肠道病毒基因组长度约7500bp,其序列由衣壳蛋白和复制蛋白以及两端的5’UTR和3’UTR构成。根据基因组的亲缘关系将可为A、B、C、D四大类,其中A类肠道病毒包括如CVA6、CVA10、CVA16、EVA71的传统型毒株和EVA76、EVA89等非传统型毒株。由于肠道病毒衣壳结构的差异,其感染宿主细胞所需受体也有差别。目前发现的A类肠道病毒所用受体包括SACARB2和KRM1等。其中SCARB2作为受体与病毒的相互作用机制已经比较完整,但是KRM1作为病毒受体与病毒之间相互作用机制仍缺乏系统的研究。本课题中,在目前KRM1和肠道病毒的研究的基础,我们深入研究了肠道病毒与KRM1之间的相互作用,并发现KRM1上96位的色氨酸对病毒的结合起至关重要的作用。本研究对肠道病毒与受体相互作用的研究提供了方向,并对治疗手足口病提供了新的策略。方法:首先构建慢病毒感染系统利用CRISPR/Cas9技术敲除RD细胞中的KRM1。然后构建CVA6、CVA10、CVA4、CVA12病毒的衣壳质粒转染至293T细胞,构建病毒的亚基因组复制子（5’UTR-Luciferase-P2+P3-3’UTR）质粒,利用体外转录得到亚基因组复制子的RNA（replicon）,然后转染至已转染过病毒衣壳质粒的293T细胞中构建假病毒体系。构建非传统型肠道病毒的衣壳质粒,通过密码子优化提高非传统型肠道病毒衣壳质粒表达,提高假病毒的包装效率,并探究非传统型肠道病毒的受体。利用点突变分别替换KRM1上29个氨基酸位点,然后将点突变后的KRM1回补到KRM1敲除的RD细胞中,使用假病毒感染细胞,通过荧光素酶系统检测病毒的感染进行筛选。最终发现KRM1中96位色氨酸的突变抑制病毒的感染,同时利用实验病毒株感染验证,验证的结果与假病毒结果一致。最后利用病毒的结合实验验证该氨基酸的突变影响了病毒与KRM1的结合,且通过免疫共沉淀实验探究该位点突变后KRM1与DKK1的结合不受该突变影响。结果:（1）成功构建了KRM1敲除的RD细胞,KRM1敲除后CVA4、CVA6、CVA10、CVA12的感染被阻断。（2）成功构建各肠道病毒的衣壳蛋白质粒、亚基因复制子,以及各病毒的假病毒。（3）成功构建了29个位点突变的KRM1质粒,且在细胞中正确表达,并成功找到KRM1上96位的色氨酸为病毒感染所必需,从而阐明该位点突变在病毒与受体结合的阶段发挥了重要的作用。（4）KRM1上96位氨基酸突变并不改变KRM1原本的其他功能,该位点的改变仅特异性阻断KRM1与肠道病毒的结合,可针对该位点开发肠道病毒的小分子抑制剂和受体阻断剂等药物。（5）通过密码子优化提高了非传统型肠道病毒的包装效率,验证非传统型肠道病毒的受体并非KRM1和SCARB2。结论:本研究证实了KRM1为CVA4、CVA6、CVA10、CVA12的关键受体,且KRM1上96位的色氨酸在病毒与受体的结合阶段发挥了重要作用。同时,鉴定KRM1以及SCARB2均不是非传统肠道病毒的受体。该研究填补了我们对肠道病毒与受体的相互作用机制的认识空白,并为设计特异性阻断病毒入侵的干预策略提供了新的思路奠定了前期基础。