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原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)是配子发生的祖细胞,配子发生涉及多步复杂的过程,但是关于家禽精子的发生过程与机制至今仍不清楚。近年来,种鸡繁殖力持续下降的问题始终困扰家禽产业的发展。研究表明,每年有5-12%的种公鸡因产精能力低下遭到淘汰,种鸡出苗率下降,呈现“倒挂”趋势,这与种公鸡精子发生密切相关。其次,转基因鸡作为生物反应器具有巨大的潜力,可用于生产高价值的药用蛋白;采用人工改造的方法对PGCs进行外源基因引入,再通过体外诱导产生成熟精子是生产转基因鸡和生物反应器的主要方式之一。因此,通过体外诱导体系研究可以重现家禽体内精子发生过程中PGCs分化形成精子的精确过程,进而建立禽类精子发生机制研究的重要平台。本文将体外培养的鸡PGCs诱导分化形成精原干细胞样细胞(Spermatogonial Stem Cells Like Cells,SSCLCs),并启动减数分裂过程,探明诱导过程中基因表达变化的动态图谱,为进一步深度解析禽类精子发生过程和转基因鸡生产奠定基础。试验结果如下:1、为得到体外培养的鸡PGCs,试验首先利用胰蛋白酶消化4.5-5.5 d鸡胚性腺,成功分离并使用有饲养层培养基培养得到鸡PGCs;为了提高体外培养的PGCs纯度和增殖效率,试验通过添加适用于干细胞无饲养层培养的细胞因子对有饲养层培养基进行改良,配置成无饲养层培养基。结果表明,在优化后的无饲养层培养基中,连续培养4d后PGCs呈小团聚集,培养7d后大量PGCs聚集在一起,这种聚集现象比在有饲养层培养系统中更明显,更有利于PGCs的短期快速增殖和更新(25 d),且纯度较高(40%以上);且发现同时添加B27、CS和N2三种细胞因子有利于PGCs的体外增殖和更新;细胞免疫荧光染色证明,有、无饲养层培养基体外培养的PGCs仍保持多能性和生殖特性且未发生分化,为后续PGCs体外诱导分化做好准备。2、为探究细胞因子bFGF和GDNF对鸡PGCs的体外诱导作用,试验通过在诱导培养基中分别添加bFGF和GDNF对鸡PGCs进行体外诱导。流式细胞分析发现,与同时添加bFGF和GDNF组相比,不添加bFGF/GDNF组和单独添加bFGF或GDNF组双阳性SSCLCs 比例均显著降低(P<0.05);且荧光定量PCR检测结果发现,同时添加bFGF和GDNF因子后CVH、ITGA6基因表达均显著高于其他两组(P<0.05),且减数分裂启动基因STRA8高表达,说明细胞因子bFGF和GDNF对PGCs的诱导分化具有重要作用。鉴于以上试验结果,确定了含有重要细胞诱导因子bFGF和GDNF的鸡PGCs体外分化形成SSCLCs且进入减数分裂的体外诱导体系。3、为阐明鸡PGCs体外诱导过程中双阳性SSCLCs 比例变化及基因表达变化的动态图谱,首先使用上述构建的体外诱导体系对有饲养层培养基培养的鸡PGCs进行体外诱导。结果发现,诱导24h后出现Integrin-α6阳性SSCLCs,诱导48 h后Integrin-β1和SSEA-1双阳性SSCLCs的比例最高达到27.9%;荧光定量PCR分析结果发现,OCT4基因在诱导48 h后显著降低(P<0.05),生殖标志基因DAZL和ITGB1在诱导72 h后表达量显著升高(P<0.05),说明诱导后细胞逐渐退出多能性和自我更新状态,而生殖标志基因高表达,即朝着生殖方向分化;同时减数分裂启动基因STRA8在诱导48 h后显著上升(P<0.05),诱导72 h又呈现下降趋势;联会复合体基因SYCP3在诱导48 h表达下降,但差异不显著,而诱导72h表达量又显著升高(P<0.05),说明PGCs诱导后细胞已启动减数分裂活动,并且已经处于减数分裂I期,正在发生同源重组等重要的生物学事件。同样,无饲养层培养基培养的PGCs体外诱导分化形成SSCLCs过程中细胞逐渐退出多能性状态,而生殖标志基因CVH、ITGB1高表达,减数分裂标志基因STRA8和SYCP3也高度表达,标志细胞进行减数分裂;且无饲养层培养系统在本实验诱导体系下体外诱导效果更佳(效率提高了 24%)。4、为探究不同性别PGCs在诱导分化中因相互干扰对形成SSCLCs的效率的影响,分别诱导雄性和雌雄混合的PGCs,发现两组中SSCLCs的比例均随着诱导时间的延长而增大,雌雄混合PGCs中双阳性SSCLCs的比例在诱寻72h后比雄性FGCs组中高13.8%,说明在此诱导体系条件下,雌性PGCs对雄性PGCs体外分化形成SSCLCs具有促进作用。综上可知,鸡PGCs在同时含有重要诱导分化因子bFGF和GDNF的诱导培养基中体外分化为SSCLCs,成功建立了鸡PGCs分化为SSCLCs的体外诱导分化体系,诱导后的细胞进入减数分裂活动;无饲养层培养基更有利于PGCs的增殖和更新,诱导分化为SSCLCs效率更高;且雌性PGCs对雄性PGCs体外分化形成SSCLCs具有促进作用。