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猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的一种猪的急性传染病,临床上主要引起母猪的繁殖障碍、产死胎或木乃伊胎,仔猪出现神经症状,最后转归于死亡。近30年来我国广泛应用PRV基因缺失疫苗,使该病得到有效控制。但2011年底该病毒再次爆发流行,给我国的养猪业带来了空前巨大的损失。多个研究报告证明,该流行毒株毒力增强,抗原性发生明显变异。本研究通过对伪狂犬病的病原学与血清学检测,证明了该病在华东地区发生流行,成功建立了伪狂犬病毒经典毒株与变异毒株PCR鉴别诊断方法,并制备伪狂犬变异毒株基因缺失灭活疫苗,进行了免疫效果测定,为该病防控奠定了重要基础。本研究包括以下3个部分:1.华东地区猪伪狂犬病流行病学调查与流行毒株分离鉴定为了解猪伪狂犬病在华东地区发生与感染状况,本研究对2012-2015年江苏、山东、浙江和安徽四省进行了伪狂犬病血清学和病原学的流行病学调查与PRV流行毒株分离鉴定,结果为:(1)血清抗体:血清PRV gB抗体阳性率平均为92.3%(7119/7716);gE抗体阳性率从2012年的0%上升到2014年的34.9%,2015年降至31.6%,平均抗体阳性率达到30.7%(2189/7130)。在参与调查的4个省中浙江省阳性率最高,达到了 42.1%,安徽最低,为24%。gE猪场阳性率2012-2015年分别为:0%、40.8%、55.0%、65.0%,平均阳性率为52.6%(162/308),其中2014年4个省的猪场阳性率均为100%。(2)PRVPCR检测:2013-2015年PRV野毒感染率分别为14.1%、24.9%、28.9%,平均感染率为25.1%(121/481);猪场阳性率分别为:22.7%、36.5%、40.5%,平均猪场阳性率为37.3%。(3)病毒分离鉴定:从4份伪狂犬阳性病料中分离出4株病毒,经PCR鉴定均属于伪狂犬病毒流行毒株。以上数据表明伪狂犬病毒在华东地区广泛流行,为该病防控提供了理论依据。2.鉴别伪狂犬经典毒株与变异毒株的PCR方法的建立为了有效区分变异毒株和经典毒株,根据国内外伪狂犬病毒(PRV)变异毒株和经典毒株基因序列比对结果,针对UL44和UL36区域的基因序列设计了两对引物,建立两步法PCR。第一步PCR针对UL44区域,区分出经典毒株(疫苗株HB98除外)感染与变异毒株感染。第二步PCR针对UL36区域,区分出HB98与伪狂犬变异毒株。两步法PCR的敏感度分别达到2-20TCID50和50TCID50病毒量。对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、日本脑炎病毒、脑心肌炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核酸应用此方法进行扩增,结果均为阴性。该方法与猪伪狂犬病毒国家标准PCR检测方法的符合率达到91%,可用于该病实验室快速诊断。3.猪伪狂犬病毒gE/gI缺失灭活疫苗制备与免疫保护效力试验本研究通过对伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失毒株rZJ01 △gE/gI进行灭活条件优化,采用3种不同佐剂制成灭活疫苗。小鼠免疫保护试验结果表明,甲醛灭活后辅以15A佐剂制成的疫苗(rZJ01/F/15A)免疫效果最好,一次免疫后3周即可产生较高水平PRV gB ELISA抗体,二次免疫后3周中和抗体效价达1:158。猪体免疫保护试验结果表明,甲醛灭活辅以206佐剂制成的疫苗(rZJ01/F/206)免疫保护效果最好,一次免疫后3周即可产生较高水平的PRV gB ELISA抗体和中和杭体,二次免疫后2周gB抗体与中和抗体效价达1:256。二次免疫后2周采用致死剂量的PRV ZJ01株攻击感染,非免疫攻毒组明显发病,而rZJ01/F/206组仅表现短时体温升高,肺脏、脑、肝脏组织中PRV载量最低,肉眼病变与组织学病变轻微,表明rZJ01/F/206可以有效保护PRVZJ01强毒株攻击,可作为PRV的一种理想候选疫苗。