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骨性关节炎（osteoarthritis,OA）是一种常见的关节退行性疾病,疼痛是其最主要的临床症状。随着OA的发展,患者可能会出现慢性疼痛、运动范围受限和畸形等症状,严重影响其日常生活活动。OA疼痛的机制十分复杂,大量研究发现OA的放射学改变与疼痛之间往往没有关联性。越来越多的研究也已经证明,除了关节和相关结构的损伤外,OA疼痛还与疼痛通路的敏化有关,其涉及关节痛觉感受器的变化以及脊髓、脑干和丘脑皮质系统对痛觉处理的变化。OA慢性疼痛难以治愈的重要原因可能是疼痛通路中枢敏化与外周敏化的出现。因此,治疗OA慢性疼痛除了要考虑减少关节结构的损害外,还更应该考虑如何缓解疼痛通路的敏化。先前研究已经发现A型肉毒毒素（botulinum toxin type A,Bo NT/A）可以降低外周敏化进而缓解疼痛,另外,经颅直流电刺激（transcranial direct current stimulation,t DCS）也被发现可以降低中枢敏化发挥镇痛作用,但目前还没有研究将二者联合起来治疗OA引起的慢性疼痛,且对于经颅直流电刺激的镇痛机制也并未研究清楚,因此,本研究第一部分使用经颅直流电刺激（t DCS）对OA慢性疼痛大鼠进行治疗,观察其疗效及作用机制,第二部分将A型肉毒毒素（Bo NT/A）联合经颅直流电刺激对OA慢性疼痛的大鼠进行治疗,观察联合治疗效果及作用机制。本研究可以为临床治疗OA慢性疼痛提供新思路和新方法,更好的解决患者的痛苦。第一部分经颅直流电刺激对大鼠骨性关节炎慢性疼痛的治疗作用及机制的研究目的:骨性关节炎（OA）是导致慢性疼痛最常见的原因,经颅直流电刺激（t DCS）已广泛应用于治疗神经疾病和慢性疼痛。t DCS的镇痛效果显著,但其作用机制仍不明。本研究观察了t DCS是否能够缓解OA大鼠的慢性疼痛以及大鼠中脑导水管周围灰质（periaqueductal gray,PAG）中N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体水平的变化,以此探讨t DCS的镇痛效果及机制。方法:（1）随机选取60只雄性SD大鼠,将60ul单碘乙酸钠（monosodium iodoacetate,MIA）注射至大鼠的左踝关节腔内,建立OA的慢性疼痛模型。另外,再随机选取10只大鼠,在同一部位注射60ul生理盐水作为对照,并分别在模型建立的前1天及模型建立后的第1、3、7、14、和21天对大鼠的疼痛行为进行测定,以此评估OA慢性疼痛模型的建立情况。（2）模型建立后,大鼠接受为期14天的t DCS治疗。将注射生理盐水和MIA的大鼠随机分为6组（每组10只）,分别为sham组、MIA组、MIA+t DCS组和MIA+St DCS组（注:sham transcranial direct current stimulation,St DCS为经颅直流电假刺激）。另有2组大鼠在t DCS治疗之前,对大鼠进行脑室内注射（intracerebroventricular,i.c.v.）艾芬地尔（Ifenprodil）和磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）,即2组分别为MIA+Ifenprodil（i.c.v.）+t DCS组和MIA+PBS（i.c.v.）+t DCS组。在t DCS干预后第7、14天测定各组大鼠的疼痛行为（3）行为学检测完成后,使用蛋白免疫印迹法检测不同组大鼠PAG中N-甲基-D-天冬氨酸2B亚基受体（N-methyl-D-aspartate receptor-2B,NMDAR2B）的表达水平,免疫组织化学法检测PAG中NMDAR2B、c-Fos阳性细胞数变化情况。结果:（1）与sham组相比,MIA组大鼠在造模后机械痛撤足阈值（Paw withdrawal threshold,PWT）和热痛撤足阈值（Paw withdrawal latency,PWL）显著下降（P＜0.0001）。与MIA组相比,大鼠在t DCS治疗后14天,PWT显著增加（P＜0.0001）,但MIA+St DCS组和MIA组无显著差异（P＞0.05）。同样,与MIA组相比,在第7天和第14天,t DCS治疗显著上调了PWL（P＜0.05、P＜0.001）。与MIA+Ifenprodil（i.c.v.）+t DCS组相比,MIA+PBS（i.c.v.）+t DCS组在t DCS治疗后14天,PWT明显增加（P＜0.01）,在第7天和第14天时,PWL显著上调（P＜0.01、P＜0.0001）。（2）蛋白免疫印迹结果显示,MIA组大鼠的PAG中NMDAR2B表达水平较sham组增加（P＜0.001）。与MIA组相比,MIA+t DCS组NMDAR2B蛋白表达增加（P＜0.001）,与MIA+Ifenprodil（i.c.v.）+t DCS组相比,MIA+PBS（i.c.v.）+t DCS组NMDAR2B蛋白表达增加（P＜0.01）,MIA+St DCS组和MIA组之间未观察到显著差异（P＞0.05）。（3）免疫组织化学法结果显示与MIA组相比,MIA+t DCS组PAG中NMDAR2B阳性细胞表达显著增多（P＜0.001）,与MIA+Ifenprodil（i.c.v.）+t DCS组相比,MIA+PBS（i.c.v.）+t DCS组NMDAR2B阳性细胞表达明显增多（P＜0.01）,MIA+St DCS组和MIA组之间未观察到显著差异（P＞0.05）。与MIA组相比,MIA+t DCS组PAG中c-Fos阳性细胞表达减少（P＜0.01）,与MIA+Ifenprodil（i.c.v.）+t DCS组相比,MIA+PBS（i.c.v.）+t DCS组c-Fos阳性细胞表达减少（P＜0.01）,MIA+St DCS组和MIA组之间未观察到显著差异（P＞0.05）。结论:经颅直流电刺激可能通过增加中脑导水管周围灰质中的NMDA2B受体进而增强下行抑制通路,减少神经通路的敏化,以此减轻OA引起的慢性疼痛。第二部分A型肉毒毒素联合经颅直流电刺激对大鼠骨性关节炎慢性疼痛的治疗作用及机制的研究目的:观察踝关节注射A型肉毒毒素联合经颅直流电刺激对骨性关节炎大鼠慢性疼痛的疼痛行为及PAG中NMDAR2B受体表达的影响,探讨Bo NT/A和t DCS对OA慢性疼痛联合治疗的疗效及机制。方法:（1）随机选取45只雄性SD大鼠,将60ul单碘乙酸钠（monosodium iodoacetate,MIA）注射至大鼠的左踝关节腔内,建立大鼠OA慢性疼痛模型。另外,再随机选取12只大鼠,在其左踝关节腔内注射60ul生理盐水作为对照,并分别于模型建立的前1天及模型建立后的第1、3、7、14、和21天对大鼠的机械痛撤足阈值和热痛撤足阈值进行测定,以此评估OA慢性疼痛模型的建立情况。（2）待大鼠骨性关节炎慢性疼痛模型建立成功后,将注射生理盐水和MIA的大鼠随机分为5组（每组10只）,分别为sham组、MIA组、MIA+Bo NT/A+t DCS组、MIA+Bo NT/A+St DCS组、MIA+NS+t DCS组（注:Bo NT/A为A型肉毒毒素,NS为生理盐水,St DCS为经颅直流电假刺激）。将5IUBo NT/A注射至大鼠的左踝关节腔内,同时对大鼠进行为期14天的t DCS治疗。分别于Bo NT/A和t DCS干预后7、14天对各组大鼠的疼痛行为进行测定。（3）行为学检测完成后,使用Western Blot法检测不同组大鼠PAG中NMDAR2B的表达水平,免疫组织化学法检测PAG中NMDAR2B阳性细胞数变化情况。结果:（1）与sham组相比,MIA组大鼠在造模后机械痛撤足阈值（Paw withdrawal threshold,PWT）和热痛撤足阈值（Paw withdrawal latency,PWL）显著下降（P＜0.0001）。与MIA组相比,三个治疗组的PWT均显著增加（P＜0.001）,MIA+Bo NT/A+t DCS组PWT增加幅度最大,MIA+Bo NT/A+t DCS组与MIA+Bo NT/A+St DCS组有统计学差异（P＜0.01）,MIA+Bo NT/A+t DCS组与MIA+NS+t DCS组有统计学差异（P＜0.0001）。同样,与MIA组相比,在第7天和第14天,Bo NT/A和t DCS治疗显著上调了三个干预组的PWL（P＜0.001）,MIA+Bo NT/A+t DCS组PWL增加幅度最大,MIA+Bo NT/A+t DCS组与MIA+Bo NT/A+St DCS组有统计学差异（P＜0.01）,MIA+Bo NT/A+t DCS组与MIA+NS+t DCS组有统计学差异（P＜0.001）。（2）蛋白免疫印迹结果显示,MIA组大鼠的PAG中NMDAR2B表达水平较sham组明显增加（P＜0.001）。与MIA组相比,三个治疗组PAG中NMDAR2B蛋白表达均增加,MIA+Bo NT/A+t DCS组增加最明显。（3）免疫组织化学结果显示与MIA组相比,三个治疗组PAG中NMDAR2B阳性细胞表达均增多（P＜0.01）,MIA+Bo NT/A+t DCS组增加最明显。结论:A型肉毒毒素联合经颅直流电刺激对治疗骨性关节炎慢性疼痛有更好的治疗效果,其可能的机制是通过增加中脑导水管周围灰质中的NMDAR2B受体进而减少疼痛通路的敏化以此减轻慢性疼痛。