前言：恶性肿瘤是机体自身细胞在各种内外致癌因素作用下发生恶性转化而发生的，它与机体免疫系统的关系十分复杂。由于肿瘤细胞表面存在着可被机体识别的肿瘤抗原，所以可以引起一系列免疫应答，即肿瘤免疫。但是，又由于肿瘤细胞表面抗原的调变，使免疫系统不能识别恶变细胞，从而逃避宿主的免疫攻击，即肿瘤免疫逃逸。 粘附分子在肿瘤T细胞免疫中起着重要的作用。T细胞的活化除了需要抗原肽—MHC分子复合物提供的刺激信号外，粘附分子的协同刺激作用也是必不可少的。肿瘤细胞表面粘附分子表达的减少或缺如可造成T细胞的无应答状态，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。肿瘤细胞表面粘附分子表达的改变还影响到细胞之间正常的联接，提高了细胞的侵袭转移能力。作为一种致死率极高的恶性肿瘤，卵巢上皮性癌细胞表面也存在着多种粘附分子表达的减少或缺如，并认为其与肿瘤免疫逃逸和侵袭转移关系密切。 OPCML(OBCAM)是一种细胞表面的粘附分子，是免疫球蛋白超家族成员之一，主要分布于人体大脑皮层和海马中。在神经系统中，OPCML分子主要起着促进神经细胞突起生长和介导细胞与细胞之间联接的作用。有研究表明在卵巢上皮细胞表面存在着OPCML的表达，而在卵巢上皮性癌的细胞表面这种分子表达缺如。由此我们推测OPCML分子与其他细胞表面粘附分子一样，参与了肿瘤细胞的免疫逃逸，同时又对癌细胞的早期种植转移起了重要2004年浙江大学硕士学位论文论文作用。恶性肿瘤中基因失表达的常见途径有基因突变、丢失和启动子甲基化。各种机制随着肿瘤类型的不同发生率也不同。在部分肿瘤中，基因启动子的甲基化是基因失表达的唯一机制。鉴于启动子甲基化在基因失表达机制中的重要地位，推测OPCML基因的失表达也与基因启动子的甲基化有关。本研究通过RT一PCR检测卵巢上皮性癌组织及细胞株表面OPCML mRNA的表达，并探索导致这个分子表达减少的可能机制，为卵巢上皮性癌的基因治疗提出新的靶位点。材料与方法:组织标本:从浙江大学医学院附属妇产科医院中心实验室冰冻组织标本库中选择1999年7月至2003年7月的卵巢上皮性癌患者72例，中位年龄为51.5岁(32一78岁)。按组织类型分:浆液性腺癌58例，其中高分化腺癌6例，中分化腺癌8例，低分化腺癌44例;粘液性腺癌14例，其中高分化腺癌3例，中分化腺癌3例，低分化腺癌8例。手术病理分期:}期患者2例，11期患者17例，Hl期患者50例，W期患者3例。选取同期卵巢良性上皮肿瘤患者17例，及因其他妇科良吐疾病而行手术治疗并在术中进行卵巢活检或切除的患者20例作为对照，中位年龄分别为39.0岁(21一70岁)和46.5岁(38一58岁)。卵巢癌细胞株:SKOV一3和CAOV3细胞株均购自美国ATCC组织细胞库，3A0细胞株购自上海细胞所。用RT一PCR的方法检测组织与细胞中OPCML mRNA的表达情况。如果细胞中有OPCML mRNA存在，经逆转录后PCR则有一327bp长度的扩增产物，否则电泳无目的条带出现。用限制性内切酶一PCR的方法检测组织与细胞中OPCML基因启动子甲基化的情况。对所扩增的OPCML基因启动子序列中的CPG位点进行分析，发现可被限制性内切酶HaPH识别的位2004年浙江大学硕士学位论文论文点4个，可被限制性内切酶ACcH识别的位点2个，可被限制性内切酶Aatn、Cfrl3I识别的位点各1个。甲基敏感限制性内切酶可以特异性识别一定的CpG位点，若该位点没发生甲基化，则DNA序列被切断，扩增后无目的带形，如果发生甲基化，该位点则不能被切断，可以扩增出PCR产物。用同一样本经甲基化酶5551预处理后再酶切作为阳性对照，不加模板作为阴性对照，MSp工酶切后的样本作为HaPH的阴性对照。甲基化敏感限制性内切酶HaPH识别CCGG;Aat 11识别位点GACGTC;AcC 11识别位点CGCG;Cfrl3I识别位点GGNCC。每一标本重复三至四次，出现两次以上阳性结果的判定该位点甲基化。结果:在卵巢正常组织、良胜肿瘤和上皮性癌中OPCM[J mRNA的表达率分别为85%，76.5%和19.4%，在卵巢癌中的表达显著低于正常卵巢组织(x之二30.108，户0.0000)和卵巢良性上皮性肿瘤组织(x竺=21.162，乃0.000)。但是不同病理类型、不同分化程度以及不同手术病理分期之间无显著差异。SK0v一3和CAOV3未见OPCML mRNA表达，而3A0有表达。启动子甲基化在3种组织中的阳性率分别为0%，0%和44.4%，在卵巢癌中显著高于卵巢正常组织(X止二13.630，户0.0000)和良性肿瘤(xZ二一r.797，产0.000)。卵巢癌oPcML启动子甲基化和mRNA失表达呈显著相关(相关系数r一11.589，丹0.002)。HaPH内切酶位点甲基化在卵巢癌中显著高于正常组织(x七=7.099，户0.005)和良性肿瘤(x:=6.091，介0.010)并与OPCML mRNA失表达显著相关(相关系数r=1 1.640，产0.004)。SKOV一3和CAOV3有内切酶位点甲基化，而3A0无酶切位点甲基化。结论:卵巢上皮性癌细胞存在OPCML基因失表达。2、基因启动子CpG岛，尤其是Hapn位点的甲基化是导致OPCML基因失表达的途径，但不是唯一的途径。