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人白细胞介素10(hIL-10)是由T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等细胞分泌的,唯一具有免疫下调作用的细胞因子。主要通过对免疫细胞的调节来发挥免疫抑制、免疫调节以及抗炎症作用。在临床上广泛应用于炎症性肠病、急性肺损伤、类风湿性关节炎、丙型肝炎、再灌注损伤、银屑病、多发性硬化以及实验性脓毒败血症休克等疾病的治疗。乳腺生物反应器是指利用乳蛋白基因的调控序列构建乳腺特异性表达载体,指导目的基因在转基因动物的乳腺内高效、特异表达的转基因技术。通过这项技术,可以从转基因动物的乳汁中获得具有生物活性的外源蛋白。乳腺是专门化的分泌腺体,生产出的药用蛋白具有完全的生物活性。而且,生产出的蛋白纯化简单,投资少、效益高,不会对环境造成污染,对转基因动物生理代谢和生长发育影响较小,在生产药用蛋白的方面具有无可比拟的优点,因此也被称为“分子农场”。本研究以牛全基因组DNA为模板,通过PCR克隆了牛p-酪蛋白(bβ-CN)基因5’调控区序列,以人的全基因组DNA为模板克隆出了人hIL-10基因的全部编码序列、上游调控序列以及部分内含子,并将两者连接。利用双酶切的方法从pEGFP-N1质粒中得到了EGFP启动子及其编码序列。并以共注射的方式将它们注射到KM小鼠受精卵雄原核内,体外培养后将形态正常的胚胎移入受体小鼠输卵管。试验结果如下：1.hIL-10基因的克隆参照Genbank中注册的X78437 hIL-10基因序列设计引物,运用PCR技术,以人全基因组DNA为模板,扩增片段长1558bp的hIL-10序列。将扩增产物与pEGM-T连接,构建重组质粒pEGM-hIL-10,经质粒PCR、酶切及序列测定表明,扩增序列成功插入pEGM-T,且该序列与X78437同源性达到99%,成功克隆出hIL-10基因。2.牛β-酪蛋白基因5’端调控序列的克隆参照Genebank中注册的X14711 bβ-CN序列设计引物,运用PCR技术,以荷斯坦奶牛全基因组DNA为模板,扩增长745bp的牛β-酪蛋白5’端调控序列。将扩增产物与pEGM-T连接,构建重组质粒pEGM-bβ-CN,经PCR、酶切及序列测定表明,扩增序列成功插入pEGM-T,且该序列与X14711的同源性达98.29%,成功克隆出了bβ-CN5’端调控区序列。3.目的基因的连接用DNA连接酶将克隆出的bβ-CN5’端调控序列和hIL-10基因连接,得到了2303bp的DNA序列,将连接产物与pEGM-T连接,构建重组质粒pEGM-hIL-10-b β-CN,经PCR、酶切及序列测定表明,扩增序列成功插入pEGM-T,且该序列与目的基因的同源率达98.19%,目的片段连接成功。4. EGFP编码序列的获取利用双酶切的方法从pEGFP-N1质粒中得到了EGFP启动子区及全部编码序列约1900bp的DNA序列。5.显微注射：通过显微注射和体外培养共获得了300个正常的2细胞胚胎,而且获得了4细胞胚胎,说明载体在受精卵发育过程中,对胚胎的正常生长发育没有影响。